分子生物学课件 第十四章 基因芯片与芯片实验室.pptVIP

第十四章 基因芯片与芯片实验室 生物芯片技术是随着“人类基因组计划”的进展而发展起来的,是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。该技术融微电子、微机械、化学、物理、计算机等学科的技术于一体,是分子生物学技术与其它学科相互交叉和渗透的产物。因常用玻片/硅片等材料作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。 特点：连续化、集成化、微型化,具有高信息量,快速,微型化,自动化,成本低,污染少,用途广 用途：农业、生物、食品、医学、军事、环境科学 种类：蛋白质芯片、基因芯片和芯片实验室 第一节 基因芯片 基因芯片又称DNA芯片，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。它是指在固相载体上，按照特定的排列方式固定上大量序列已知的DNA片段，形成DNA微矩阵。将样品基因组DNA或RNA通过体外复制合成、PCR/RT-PCR扩增等技术掺入标记分子后，以单链分子的形式，与位于微阵列上的已知序列杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即可获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息，以达到疾病诊断、药物筛选、DNA序列测定和基因功能研究等目的。 基因芯片技术的基本原理 基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。 其原理是基于核酸分子碱基之间(ＡＴ/ＣＧ)互补配对的原理,利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术，将基因或DNA分子排列在特定固体物表面构成的微点阵。然后,将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现多到数万个分子之间的杂交反应,高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因(DNA)分子的存在。 基因芯片技术的分类 cDNA芯片：由Schena建立,将特定的cDNA经PCR扩增后借助机械手直接点到基片上。 寡核苷酸芯片：由Fodor首先报道,用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸,分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片 基因芯片的制备流程 基因芯片技术主要包括五个基本环节： 载体材料的选择 芯片的制备 样品的制备和标记 杂交反应 信号的检测与数据分析。 载体材料的选择 制作生物芯片的载体材料必须是固相支持物和膜相支持物。大致可分为四类：无机材料、天然有机聚合物、人工合成的有机高分子聚合物、各种高分子聚合物制成的各种膜。 芯片的制备 芯片的制备是芯片技术的关键,目前有两种方法： ①原位合成：有光去保护并行合成法、微流体模板固相合成法、分子印章法、压电打印法,一般用于较短的探针。原位合成适用于寡核苷酸,但是产率较低。 ②合成点样：有机械点样法和化学喷射法, 点样法是将提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因组DNA或其他生物分子通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。大多中小型公司采用。 原位合成法 原位合成法包括光导合成法，压电合成法和分子印章法。 （1）光导合成法由著名的Affymetrix公司率先开发，可用于寡核苷酸和寡肽的合成,所使用的片基多为无机片基,现在也有用聚丙烯膜的。 （2）压电法的装置和合成方法类似于喷墨打印机，即将墨汁用四种碱基合成试剂代替，由计算机依据预定程序在特定方向自动控制打印喷头在芯片上移动，将特定的 DNA 碱基合成试剂喷洒到特定位置上，以固相合成原理与该处支持物发生偶联作用，然后固定、冲洗、去保护、偶联等，不断重复以上步骤直到合成预先所设计的DNA探针。 （3）分子印章原位合成法是中国东南大学吴健雄实验室发明的。方法是根据所要制备的微阵列，主要是寡核苷酸阵列，设计出一组不同的图形的微印章，然后按预先的设计把不同的化学单体，涂在不同的印章表面，然后依次压印在基板表面 用光刻法合成DNA芯片 点样法 点样法是指把预先提取好的 DNA 探针或者cDNA 等准确快速地直接点在经特殊处理的芯片支持物上，与表面反应后再由紫外线交联或Schiff碱连接法固定、变性、冲洗和晾干而成。包括接触点样法和非接触点样法 新开发的加样方法 新开发的加样方法，包括三维芯片、流过式芯片及交变电磁场等芯片使用的方法。 样品的制备和标记 样品的制备和标记：主要是对样品DNA或RNA的分离提纯及PCR扩增,并对靶基因标记。样品的制备：生物样品往往是各种生物组分混合体,成分非常复杂,如果直接与芯片反应,各组分相互干扰现象非常严重,因此,除少数特殊情况外一般必须将样品先进行分离纯化、扩增,获取其中的DNA、RNA,并用荧光标记,才能与芯片进行反应。 样品的标记方法有放射性核素标记法及荧光色素法等 杂交反应 杂交反应：属于固液相反相杂交,探针分子固定于芯片表面,与液相的