免疫学实验：T淋巴细胞转化试验.pptVIP

Mar. 5, 2013 T淋巴细胞转化试验 主 要 内 容 实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定 实验分组及材料 分组：每组4人 原 理 Lymphocytes(B/T) mitogens Specificity Ag Proliferation transformation lymphoblast Nucleic Acid↑ Protein ↑ T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体， 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。 有丝分裂原 有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。 T和B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。 常用的丝裂原 T cell proliferation 植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T） 刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) B cell proliferation 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) 常用的检测方法 形态学观察法 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法） 本次实验采用 MTT法 形态学检测方法 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率： 3H-TdR掺入法 G0 G1 有丝分裂原 特异性抗原 S Pr,RNA,DNA 前体物质 DNA↑↑ New DNA 3H-TdR TdR 3H-TdR cpm T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量（以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低。 测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。 MTT法 MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。 活/增殖 期的细胞 线粒体 能量代谢 琥珀酸脱氢酶 MTT MTT掺入 还 原 甲臢颗粒 formazan 细胞内/周围 溶解 测OD490值 DMSO 操作流程 第一天 1. 杀鼠、 取脾、捣碎、 获得细胞、 计数 2.细胞稀释（1×107）， 上样 （100ul/孔） 3. ConA 的梯度稀释，上样 （100ul /孔） 4.将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37℃ 培养48小时。 第三天 1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值 1W 无菌取脾 研磨成单细胞悬液+1640 （无FBS) 细胞计数【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝 加板(三复孔) (加法见附图) 调细胞浓度 1×107个 /ml 5%CO2 37℃培养48小时 培养终止前2小时加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 5% CO2 37℃ 继续培养2小时 2000rpm 10min 小心弃去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒