免疫学实验：免疫理论.pptVIP

免疫动物的选择 供免疫用的动物主要有哺乳类和禽类．其中常用的有小鼠、家兔、山羊、绵羊、豚鼠、鸡、驴和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质、抗体需要量等因素。如某些激素类抗原多用家兔制备；对于难以获得的抗原，或抗体需要量少的情况，可用小鼠制备。 免疫佐剂 佐剂（adjuvant ）：一类非特异性免疫增强剂，先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。 作用原理：增加滞留时间、增强机体免疫敏感性 佐剂种类 a. 油性乳剂 b. 无机化合物 c. 微生物及其产物 d. 脂质体 e.免疫刺激复合物（ISCOM） f. 细胞因子 弗氏佐剂（Freund’s adjuant） 抗体制备时常用的佐剂 弗氏不完全佐剂 羊毛脂+液体石蜡 弗氏完全佐剂 羊毛脂+液体石蜡+卡介苗 首次免疫用完全佐剂，后续免疫用不完全佐剂。 多克隆抗体的分离与纯化 抗血清的制备： 取血，离心 亲和层析纯化： ProteinA/G（中性亲和，酸性解离） 杂交瘤细胞融合技术 B细胞：能分泌抗体，无法增殖。 骨髓瘤细胞：能永久传代。 杂交瘤细胞：能分泌抗体，能永久传代。 聚乙二醇（PEG）融合剂 HAT筛选（第一次筛选） 抗原筛选（第二次筛选） HAT选择 DNA合成途径：主要途径，替代途径 HAT培养基：抑制主要途径 B细胞：具备替代途径，无法增殖，自然死亡。 骨髓瘤细胞：替代途径缺失，无法生长。 杂交瘤细胞：DNA替代途径正常，具备增殖能力，稳定传代. 单克隆抗体分离与纯化 杂交瘤细胞体内培养：取腹水 杂交瘤细胞体外培养：收集培养基上清 亲和层析纯化：Protein A/G 抗体活性鉴定（效价检测） 免疫沉淀法（Immunoprecipitate，IP） 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ） 免疫沉淀法 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体以适当比例结合，在适量电解质存在条件下，经过一段时间形成肉眼可见的沉淀的现象。 抗原价：抗原决定簇 抗体价：V端抗原识别区 免疫沉淀法 不同稀释度的抗体溶液与相同浓度的抗原溶液混合，刚刚出现浑浊沉淀的抗体稀释度即为抗体的效价。 酶联免疫吸附法 原理：在固相载体上包被抗原，用相应的抗体与之识别，形成锚定在固相载体上的抗原-抗体复合物。复合物内暴露在最外端的抗体为酶标抗体，在加入相应底物后可以催化底物的生色反应，进而通过分光光度计的度数来判断复合物的生成量。 一抗：直接识别抗原的抗体 二抗：特异识别一抗FC端的抗体，具有种属保守性 ELISA分类 直接法——一抗带酶 间接法——二抗带酶 双抗夹心法——检测抗原 直接夹心法 间接夹心法 直接法 Antigen is passively absorbed to solid phase by incubation Antibodies are added and incubated with solid-phase attached antigen. Those which are specific will bind to antigen Excess antibodies or non-binding components are washed away after incubation phase Antibodies labeled with enzyme(conjμgate) directed against the particμLar species in which the original antibodies were produced(anti-species). These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjμgante is washed away after a period of incubation Substrate/chromophore is added and color develops as a resμLt of enzyme present. After a period of incubation of the colour development is ptopped and read by spectrophotometer 间接法 直接夹心法 间接夹心法 抗体效价检测：间接法ELISA ELISA法效价判定 抗体效价: 二倍于阴性对照OD值所对应的抗体稀释度 稀释度（倍） 200 400 800 1600 32