表达猪瘟病毒E2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫效力评价.pdfVIP

摘 要 猪瘟（Classical swine fever, CSF ）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV ）引起猪 的一种传染性、致死性疾病，对我国乃至全世界范围养猪业造成巨大的经济损失。目前，CSF 在 我国呈散发或地方性流行，疫苗免疫仍然是预防、控制和消灭CSF 的主要手段。猪瘟兔化弱毒疫 苗株（C 株）因其安全有效而获得广泛应用，在CSF 防控中发挥了巨大作用。但是，C 株不具有 标记特性，无法区分疫苗免疫和野毒感染动物，不利于CSF 的根除与净化。另外，C 株、亚单位 疫苗等常规疫苗均采用肌肉注射的免疫途径，易产生应激反应，且无法满足野猪的免疫需求。而 口服疫苗免疫简单、方便，不仅能够诱导全身性免疫反应，也能够诱导局部黏膜免疫，可在病原 入侵位点建立屏障，直接切断病原的入侵。乳酸菌是一种理想的口服疫苗递呈载体，能够抵抗胃 肠道酸性环境和胆盐等的侵蚀，将抗原完整地递呈至肠道免疫诱导位点，同时在维持机体肠道菌 群动态平衡、促进动物营养物质的吸收等方面发挥着巨大作用。 本研究首先利用食品级诱导表达NICE 系统，以其配套的载体pNZ8149 分别融合表达CSFV E2 蛋白与沙门氏菌侵袭蛋白RCK 或耶尔森氏菌外膜蛋白OmpH，成功构建了两株重组乳酸乳球 菌 rL.lactis-E2-RCK 和 rL.lactis-E2-OmpH 。Western blotting 检测结果显示 rL.lactis-E2-RCK 和 rL.lactis-E2-OmpH 分别成功表达了42 kDa 和39 kDa 的融合蛋白，大小与预期一致；通过家兔免 疫攻毒试验评价两株重组乳酸乳球菌的免疫效力，结果显示，将 rL.lactis-E2-RCK 和 rL.lactis-E2-OmpH 口服免疫家兔后，检测一免、二免及三免后的不同时间点免疫组家兔血清中抗 CSFV 特异性 ELISA 抗体均为阴性，中和抗体滴度﹤10；三免后 7 d 使用 C 株进行攻毒， rL.lactis-E2-RCK 和rL.lactis-E2-OmpH 免疫家兔全部产生定型热反应，两株重组乳酸乳球菌未能 提供免疫保护。之后，本研究选择定植能力更强、定植时间更长的植物乳杆菌作为载体，将植物 乳杆菌NC8 作为宿主菌株，构建了表达CSFV E2 蛋白的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2 ，体外 检测证实NC8-pSIP409-E2 成功表达了42 kDa E2 蛋白，蛋白大小与预期一致；将重组植物乳杆 菌NC8-pSIP409-E2 口服免疫小鼠进行免疫效力评价，免疫后不同时间点检测血清中的特异性IgG 抗体水平和粪便中特异性 sIgA 抗体水平，结果显示与阴性对照组相比，重组植物乳杆菌 NC8-pSIP409-E2 免疫组小鼠血清中IgG 抗体水平无明显变化，而粪便中sIgA 抗体水平略微升高； 进一步分离小鼠外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞分别进行 T 淋巴细胞亚型分析和淋巴细胞增殖 + + 试验，与对照组相比，免疫组小鼠CD4 和CD8 T 细胞比例和淋巴细胞刺激指数显著升高，表明 重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2 免疫后能够增强细胞免疫应答。最后，为了开发更合适的乳酸 菌载体，优化E2 抗原蛋白的表达和递呈，本研究中分离得到3 株野猪源乳酸菌，并对其进行了 载体开发的初步研究和安全性评价，有望将其改造为口服疫苗载体诱导高水平的免疫应答。 本研究利用乳酸乳球菌和植物乳杆菌两种载体，成功构建了表达CSFV E2 蛋白的重组乳酸乳 球菌和重组植物乳杆菌。动物试验结果表明：重组乳酸乳球菌免疫家兔后未诱导机体产生免疫应 答，未能提供免疫保护；重组植物乳杆菌免疫小鼠后诱导机体产生了细胞免疫应答。另外，分离 得到的3 株野猪源乳酸菌，有作为口服疫苗载体的潜力，可进一步应用于CSF 口服疫苗的研制。 关键词：猪瘟，E2 蛋白，黏膜免疫，乳酸菌，递呈载体 I Abstract C