鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及其免疫胶体金检测试纸条研制.pdfVIP

摘 要 鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)是一种重要的细菌性致病菌，可引起雏鸭感染发病 或死亡。已报道的鸭疫里默氏杆菌血清型有2 1 种，其中血清1、2 、10 型是国内优势血清型。外 膜蛋白 A （OmpA ）是鸭疫里默氏杆菌的重要免疫原性蛋白，在不同血清型中保守性良好。为制 备鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金检测试纸条，本研究选用OmpA 蛋白作为抗原免疫BALB/c 小鼠 制备单克隆抗体。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合后，用间接ELISA 方法筛选阳性杂 交瘤细胞株，经腹腔注射BALB/c 小鼠制备单克隆抗体。通过单克隆抗体效价及稳定性测定，秋 水仙素法进行杂交瘤细胞的染色体分析以及Western blot 法鉴定单克隆抗体特异性，共获得3 株 稳定分泌抗鸭疫里默氏杆菌 OmpA 的单克隆抗体，分别命名为2D5 、2A6 、4H8 。3 株单克隆抗 体亚型均鉴定为IgG2a ，腹水效价均测定为1:2048000 ；3 株单克隆抗体均与鸭疫里默氏杆菌血清 1 型RA-CH3 株、血清2 型RA-NJ3 株和血清 10 型RA-HXb2 株发生特异性反应，与大肠杆菌、 沙门菌和多杀性巴氏杆菌等其他禽致病菌不发生交叉反应，表明本研究制备的3 株单克隆抗体具 有良好的抗体效价和特异性，可用于鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金检测试纸条的研制。 对上述3 株单克隆抗体进行的筛选实验，选择单克隆抗体2D5 和2A6 用作胶体金试纸条的 金标抗体和捕获抗体（检测线），将山羊抗鼠IgG 抗体包被于硝酸纤维素膜（NC 膜）作为控制线， 建立了一种用于快速检测鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金检测试纸条，可检测菌液培养物和感染鸭 心脏中的鸭疫里默氏杆菌。金标抗体2D5 的最佳标记pH 是10.0，最佳蛋白标记量是18 μg/mL 。 该试纸条特异性强，可用于鸭疫里默氏杆菌的检测，与大肠杆菌、沙门菌和多杀性巴氏杆菌均不 6 出现交叉反应；灵敏度高，检测限度为1.0×10 CFU ；性状稳定，4℃条件下能保持稳定至少8 个 月；反应时间短，15 min 内完成反应。对临床样品的检测结果表明该试纸条对感染鸭心脏组织样 品的检出率高于组织样品的细菌分离鉴定。综上所述，本研究成功研制了鸭疫里默氏杆菌OmpA 单克隆抗体和免疫胶体金检测试纸条；研制的试纸条可用于细菌培养物中鸭疫里默氏杆菌的检测 和鸭疫里默氏杆菌感染病鸭的临床快速诊断。 关键词：鸭疫里默氏杆菌，胶体金，单克隆抗体，免疫胶体金检测试纸条 I ABSTRACT Riemerella anatipestifer is one of the major pathogenic bacteria in poultry, with complex serotypes and lack of cross-protection among serotypes. Serotypes 1, 2 and 10 are the domestic dominant serotypes. Outer membrane protein A (OmpA) is an immunogenic protein of R. anatipestifer and well conserved in different serotypes. To develop an immunocolloidal gold test strip for detection of R. anatipestifer, in this study, we used the OmpA protein as an antigen to immunize BALB/c mice for generating monoclonal antibodies against R. anatipestifer OmpA. After cell fusion, positive hybridoma cell lines were screened by