核酸可视化检测技术在细菌性血流感染检测中的应用.pdfVIP

核酸可视化检测技术在细菌性血流感染检测中的应用 摘 要 血流感染(Bloodstream infection，BSI)是指细菌、病毒、真菌等病原菌侵入血 液，并在血液中快速繁殖，造成机体全身系统性的血液感染疾病，是临床上重症 患者死亡的重要原因，具有很高的发病率和死亡率。其中，细菌性血流感染约占 血流感染病原菌的90%。血培养目前是临床诊断细菌性血流感染的金标准，且为 最常用的检测手段，但传统血培养耗时太长，易受多种因素的影响，阳性率低。 细菌的 16S rRNA 为所有细菌共有，存在于所有细菌的基因组中，具有高度保守性 和特异性。针对细菌 16SrRNA 的检测技术得到广泛应用，但都需通过电泳进行产 物检测，操作复杂；实时荧光PCR 技术直接对扩增产物进行实时监测避免使用电 泳，但其成本较高，在基层应用具有一定局限性。发展快速准确、简便易操作诊 断细菌性血流感染的检测方法具有重要意义。近些年来，针对细菌 16S r RNA 的 可视化核酸检测技术快速发展起来，可视化核酸检测技术不需要昂贵的仪器设备， 操作简便易行，结果清晰可见，具有非常大的优势。 本研究中，针对细菌共有的 16S rRNA 中的高度保守区域设计细菌PCR 通用 引物 ，实现细菌性血流感染快速简便检测 。引入生物素 链霉亲和素- Biotin-Avidin—System BAS （ ， ）特异亲和系统，结合微球富集技术，通过镜检， 建立基于通用置换荧光引物和微球富集技术的快速简便镜检检测细菌性血流感染 - CV-LCV 新方法；引入结晶紫 无色结晶紫内酯 （ ）体系，建立基于无色结晶紫内 酯的快速简便可视化检测细菌性血流感染的方法。主要研究内容及结果如下： 1、细菌通用引物的设计，进行检测。基于多种细菌的 16S rRNA 序列进行序 列比对，寻找细菌的高度保守区域，针对高度保守区域设计多对细菌PCR 通用引 Blast P1 P2 F1 物，并对设计的引物进行 特异性分析，证明设计的两对引物 （ 与 、 与F2）具有高特异性。通过凝胶成像系统观察电泳结果，证明设计的两对引物均 能进行细菌PCR 扩增反应。筛选出最佳细菌通用引物，实现细菌与非细菌检测。 2、微球富集荧光镜检法检测细菌性血流感染。针对细菌 16S rRNA 设计的通 用引物P1 与P2，探针P1*为P1 的互补序列。在引物P1 的5’修饰猝灭基团，探 P1* 3 5 PCR 针 的 ’端修饰荧光基团， ’端修饰生物素基团。进行 扩增反应，在没 P1* P1 有细菌靶标存在时， 与 中的荧光基团与猝灭基团接触，荧光被熄灭；在有 细菌靶标存在时，带有猝灭基团的P1参与反应，释放出带有荧光基团的探针P1*， 释放出的荧光被微球捕获并富集，在显微镜下显示出强烈的荧光信号，从而实现 3 样品检测，检测限低至 10 cfu/mL。建立PCR-显微镜快速简便镜检检测细菌性血 流感染体系，实现细菌性血流感染的检测。 3 、结晶紫可视化PCR 法检测细菌性血流感染。针对细菌 16SrRNA 设计通用 II 硕士学位论文 引物，进行PCR 扩增反应。反应产物中的dsDNA 的主要沟槽与结晶紫 无色结晶- 紫内脂体系中以微量存在的结晶紫结合，使平衡向生成结晶紫方向移动，体系显 示出明显的蓝紫色，从而实现细菌性血流感染的可视化检测，检测限低至 103 cfu/mL。建立无色结晶紫内酯快速简便可视化检测细菌性血流感染体系，实现细 菌性血流感染的检测。 关键词：血流感染；可视化检测；通用引物；荧光标记；镜检