哈茨木霉TH33疏水蛋白的异源表达及诱导烟草防御反应.pdfVIP

摘 要 疏水蛋白是高等丝状真菌中特有的一类小分子蛋白质，它们能在两相界面自动形成两亲性单 层膜，降低表面张力，协助真菌形成气生结构，并利于孢子分化与扩散。近年来的研究发现，疏 水蛋白与真菌-病原菌、真菌-植物的互作密切相关，如参与病原真菌的致病性以及有益真菌诱导 植物抗病性等多种功能。为进一步开发利用木霉菌的有益基因资源，本文开展了哈茨木霉TH33疏 水蛋白的研究，从TH33 中克隆获得6个注释为疏水蛋白的基因片段，采用基因敲除、蛋白异源表 达、全代谢组测序和转录组测序等技术，初步研究了部分疏水蛋白的功能。结果如下： 1、根据哈茨木霉TH33全基因组序列信息，TH33基因组中共含有6个疏水蛋白编码基因，序 列编号分别为Tha_00773（thhyd1 ）、Tha_02696（thhyd2 ）、Tha_03110（thhyd3 ）、Tha_04012（thhyd4 ）、 Tha_04345 （thhyd5 ）、Tha_09745 （thhyd6 ）。以TH33基因组cDNA为模板，扩增获得这6个基因的 cDNA片段，测序验证序列信息。 2 、利用同源打靶敲除的方法，获得thhyd4敲除突变株∆thhyd4和thhyd6敲除突变株∆thhyd6， 分析显示，野生菌与敲除突变株∆thhyd4 、∆thhyd6在PDA培养基中的菌落形态、生长速率、产孢 量、疏水性以及对病原菌的拮抗性能方面无显著差异。 3、利用pET-28a载体，构建thhyd2、thhyd3、thhyd4、thhyd5及thhyd6 的原核表达载体，在E.coli BL21 （DE3 ）中诱导表达并纯化，获得重组蛋白THhyd4和THhyd6 。优化的诱导表达条件为：IPTG 浓度0.5 mM、28℃、200 rpm诱导4 h 。利用pPICZαA载体构建thhyd2 、thhyd3、thhyd5 的真核表达 载体，在KM71H毕赤酵母表达系统诱导表达，获得重组蛋白THhyd3 。 4 、用纯化的重组蛋白THhyd3 、THhyd4和THhyd6处理烟草叶片，显示THhyd4和THhyd6能够 引起烟草叶片发生HR反应，诱导烟草产生活性氧、胼胝质和酚类物质累积等，表明疏水蛋白 THhyd4和THhyd6能够引起烟草发生早期防御反应，可能为蛋白类激发子。 5、对THhyd6处理后的烟草叶片，进行全代谢组和转录组测序和分析。结果显示，THhyd6诱 导烟草α-亚麻酸、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢等途径相关基因差异表达及代谢产物 的积累。其中，THhyd6诱导烟草中茉莉酸（JA ）途径信号物质积累、JA信号转导途径中关键基因 上调表达，以及多种防御相关基因发生差异表达，确定THhyd6具有激发子的功能，推测通过激活 JA信号途径诱导烟草的系统抗病性（ISR ）。 关键词：哈茨木霉，疏水蛋白，异源表达，防御反应，激发子 Ⅰ Abstract Hydrophobins are a kind of small molecular proteins in higher filamentous fungi. They can automatically form amphiphilic monolayers at the two-phase interface to reduce surface tension, and therefore help fungi to form aerogenic structure, and facilitate spore differentiation and diffusion. In recent years, it has been found that hydrophobins are closely related to the surface interaction of fungi-pathogens and fungi-plants, such as participating in the pathogenicity of pathogenic fungi and inducing plant disease resistance by beneficial fungi. In order to