表面展示副结核分枝杆菌抗原的沙门菌载体疫苗的研究.pdfVIP

摘 要 副结核病（Paratuberculosis ）是由副结核分枝杆菌 （Mycobacterium avium subsp. p aratuberculosis, MAP ）引起的以反刍动物为主的肠道慢性消耗性疾病，主要导致肉芽肿性 肠炎、持续性腹泻、逐渐消瘦和死亡。该病呈世界范围流行，给养殖业和乳品业造成巨大的 经济损失。由于目前无有效的药物治疗，因此疫苗免疫是预防副结核病的重要手段。减毒活 菌载体疫苗是将外源抗原基因插入减毒活菌载体的染色体或质粒中，通过表达和递呈外源抗 原激发免疫系统，进而达到预防一种或多种疾病的目的。目前，减毒沙门菌是疫苗载体研究 的热点，已被广泛应用于病毒和细菌等疫苗的研制，有较好的应用前景；细菌表面展示技术 是一种有效的抗原递呈策略，可将外源抗原递呈在细菌表面，使呈现在菌体表面的多肽抗原 更容易被免疫系统识别，在活载体疫苗中有较广阔的应用潜力。 本研究以减毒沙门菌为载体，冰核蛋白（Ice Nucleation Protein ）作为展示平台，构建减 毒活载体疫苗。首先利用 λRed 重组系统敲除沙门菌的外膜蛋白酶基因 ompT，使外源基因 可以稳定表达。在缺失ompT 基因的基础上缺失毒力基因lon，获得毒力进一步减弱的双缺 沙门菌。然后将目的基因MAP3061c 克隆于组成型表达pSDiGc 质粒中，电转入减毒沙门菌 中，经过免疫印迹鉴定、亚细胞组分分离、流式细胞术和免疫荧光等实验方法，确定目的蛋 白成功表达，并且展示在减毒沙门菌表面，成功构建MAP3061c 蛋白表面展示载体疫苗（INP- MAP3061c ）。 将INP-MAP3061c 免疫C57BL/6 小鼠，以灭活苗、双缺沙门菌和PBS 组作为对照，定 期称重、采取血清、分离脾脏淋巴细胞，分别检测抗体水平、细胞因子转录与表达水平、CD4+ + T 和CD8 T 细胞数量，分析体液免疫与细胞免疫水平。然后进行攻毒实验，通过检测细胞 因子变化，小鼠体重变化，以及小鼠肠、肝、脾荷菌量等评价免疫保护效果。结果表明，与 对照组相比，INP-MAP3061c 疫苗组与灭活苗组抗体水平均升高，显示INP-MAP3061c 能刺 + + 激机体产生高水平特异性抗体；INP-MAP3061c 疫苗组的CD4 T 和CD8 T 细胞显著增多， INF-γ 、IL-4、IL-17 和IL-10 等细胞因子在免疫期水平显著升高，且同脾脏中的细胞因子转 录水平基本相一致，说明 INP-MAP3061c 能够介导机体诱导细胞免疫。攻毒后，INP- MAP3061c 疫苗免疫组小鼠体重增长同灭活苗组相比没有明显差异，且脏器荷菌量低于PBS 对照组。本研究表明表面展示活载体疫苗INP-MAP3061c 对副结核病起到一定的抵抗作用， 为新型副结核疫苗的研制奠定了基础。 关键词：副结核分枝杆菌，MAP3061c 蛋白，表面展示，减毒沙门菌，免疫评价 II Abstract Paratuberculosis is a chronic infectious ailment of ruminants caused by Mycobacterium avian subsp. parat uberculosis, leading to granulomatous enteritis, persistent diarrhea, progressive wasting and death. This disease is epidemic worldwide and causes serious economic losses to the cattle and dairy industries. Currently, duo to effective drug treatment is unavailable, vaccine immunization is an important mean of preventing paratuberculosis. The attenuated live bac