慢性哮喘小鼠egfr的表达及地塞米松对其的影响.docxVIP

慢性哮喘小鼠EGF丽表达及地塞米 松对其的影响 【摘要】 目的：探讨表皮生长因子受 体在慢性哮喘气道重建中的作用.方法: 建立小鼠慢性哮喘模型，致敏前 1 h气道内 滴入地塞米松2 mg/kg，最后一次激发24 h 后处死动物，常规病理切片观察小鼠肺内炎 症情况、气管壁厚度及气道平滑肌厚度， ELISA法测定肺泡灌洗液中 TGFa的浓度, RTPCR!察小鼠肺部 EGFR mRNA表达，免 疫组化及Western Blot观察EGF滩白的表 达.结果：慢性哮喘组小鼠气道支气管及 血管周围大量炎症细胞聚集、气管壁及气道 平滑肌增厚、肺泡灌洗液中TGFa浓度增高， 肺组织EGFR mRNA EGF圈白的表达增高 ().哮喘小鼠致敏前使用地塞米松可减轻 气道炎症，减少气管壁及气道平滑肌的增厚， 肺泡灌洗液中TGFa浓度、肺组织磷酸化 EGF滩白的表达较慢性哮喘组均有所下降 ().结论：慢性哮喘小鼠出现气道重建， 早期使用地塞米松可以预防气道重建， 降低 BALF中TGFa的浓度、抑制肺组织 EGFR勺 表达和活化. 【关键词】 哮喘；气道重建；受体， 表皮生长因子；转化生长因子a ；地塞米松 0引言 气道重建是哮喘的特征性病理改变， 成 为顽固性哮喘的病理基础， 直接影响治疗效 果，是目前哮喘研究的热点问题之一.我们 建立了小鼠慢性哮喘模型，观察了慢性哮喘 小鼠气道重建情况、 表皮生长因子受体和其 配体表达的变化及地塞米松对其的影响， 旨 在探究EGF海统在慢性哮喘气道重建中的 作用. 1材料和方法 1. 1材料 6周龄雌性BALB/C小鼠40只，体质量 20~25 g ,由上海斯莱克实验动物有限责任 公司提供；UV1000紫外分光光度计；DY您 电泳仪；PCR^增仪；FLUORSTMMultimager 多功能图像分析仪；Leica Q500 MC图像分 析系统；卵白蛋白干粉；氢氧化铝；地塞米 松磷酸钠注射液；小鼠TGFa ELISA试剂盒； Trizol ; OneStep RNAPCRKit ; EGFRmAb 磷酸化EGFR mAb. 1. 2方法 1. 2. 1动物模型及分组健康 BALB/C小 鼠40只，随机等分为4组，每组10只，A 组为正常对照组，B组为慢性哮喘组，C组 为地塞米松处理组，D组为生理盐水处理组. 置于相对清洁恒温环境.予以标准饲料，自 由取水.参照文献:1］制备动物模型，将 OVA20(1 g加mg氢氧化铝溶于pH为的PBS mL中，于第0, 7, 14日给B组、C组、D组 小鼠腹腔注射，A组小鼠腹腔注射 mL PBS; 于第20~29, 47, 61,73~75 日鼻腔内滴入 OV福原液50(1 L, A组小鼠鼻腔内滴入 PBS 50从L; C组小鼠每次滴入 OVA前1 h腹腔 注射地塞米松 mL, D组小鼠每次滴入 OVAU 1 h腹腔注射PBS mL.小鼠出现烦躁不安、 呼吸急促、腹肌痉挛为阳性反应.最后一次 激发24 h后颈椎脱臼处死动物. 1 . 2. 2BALF中TGFa的检测按照 ELISA 检测试剂盒操作流程检测各组小鼠 BALF中 TGFa含量. 1. 2. 3肺组织EGFR mRNA测定根据 One Step RNA PCR Kit试剂盒说明书，用半 定量RTPCFfe测定各组小鼠肺组织 EGFR mRNAEGF罔物序列（扩增片段长499 bp）: 上游弓 I物 5 AGAAGATGGCATCCGCAAGT3 游弓 I 物 5 ATTGGG TGTCCCGAAGAGTT3 GAPD刖物序列（扩增片段长306 bp）:上 游弓 I 物 5 cctgcatccactggtgctgc3 ; 下 游弓 I 物 5 CTTGACAAAGTTGTCATTGA3 1. 2. 4Western blot 印迹测定测定肺 组织EGFF?白及磷酸化EGF港白表达. 1. 2. 5肺组织病理变化处死动物后， 取肺组织置于60 g/L固定24 h ,常规制备 病理切片，HE染色后观察肺组织病理变化. 结果为细胞核呈蓝黑色，胞质呈淡红色.参 照文献:2］关于气道各层的定义，采用德 国Leica Q500 MC图像分析系统，测定不含 软骨的完整气管横断面，分别以 WAt/ Pbm, WAi/ Pbm WAm/Pbm表示气管总管壁厚度、 内壁厚度及气道平滑肌厚度. 1.小鼠肺组织EGFRfe疫组织化学染色 米用LSAB法.处死小鼠后，取每只小鼠肺 门支气管组织行免疫组织化学染色， 随机计 数50个支气管平滑肌细胞，结果判定：-为 无棕色颗粒沉淀或棕色颗粒少量、稀疏；+ 为细胞膜区域出现淡黄色颗粒沉淀； 为细胞 膜区域出现黄色颗粒沉淀；为细胞膜区域出 现棕色颗粒沉淀. 统计学处理： 计量资料以x±s表示， 采用