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微生物限度检查 检验任务 : 金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门菌的检测 一、实验目的 熟悉药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的检验原理。 熟悉检验金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的程序与方法。二、实验材料 1、培养基和稀释液：亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基） 、卵黄高盐琼脂（或 血平板或 TMP高盐琼脂）、营养琼脂斜面培养基、甘露醇发酵管、胆盐乳糖增菌液、十六烷 三甲基溴化铵培养基、绿脓色素测定用培养基（ PDP 琼脂）、硝酸盐胨水平板（ DHL）、明胶 液化培养基，营养琼脂培养基、四六磺酸钠绿亮培养基（ TYB 増菌液）、胆盐硫乳琼脂、沙 门、志贺菌属培养基（ SS）、曙红亚甲蓝琼脂（ EMB）、麦康凯琼脂（ MacC）、三糖铁琼脂培 养（ TSI 培养基）、脲琼脂培养基、半固体营养琼脂培养基、 0.9%无菌氯化钠溶液 - 蛋白胨缓 冲液。 2、器皿 灭菌锥形瓶（ 50ml）、灭菌培养皿、刻度吸管 试剂（已配好） ： 1%二甲基对苯二胺盐试液、氯仿、  IN  盐酸、  NS 第一次 培养基的配制 培养基及稀释液： 0.9%无菌氯化钠溶液 - 蛋白胨缓冲液 配方：氯化钠 4.3g 蛋白胨 1.0g 磷酸二氢钾 3.5g 磷酸氢二钾 7.23g 水 1000ml 亚碲酸钠肉汤： 90ml/ 瓶 *3 瓶 卵黄高盐琼脂培养基（或 TMB培养基或血琼脂平板） ： 3 个 *20ml/ 个 营养琼脂斜面： 3 个平皿 * 约 20ml/ 个 甘露醇发酵管： 3 支 *5ml/ 支 TYB増菌液： 90ml/ 瓶 *3 胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂） ：20ml/ 个 *3 个 麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基） ： 20ml/ 个 *3 三糖铁琼脂斜面培养基： 5ml/ 支 *3 支 脲琼脂培养基斜面： 5ml/ 支*3 支 半固体营养琼脂培养基： 5ml/ 支 *3 支 胆盐乳糖增菌液（ BL 増菌液）： 90ml/ 瓶 *3 瓶 十六烷三甲基溴化铵平板： 6 个 *20ml/ 个 PDP琼脂斜面： 3 支 *5ml/ 支 硝酸盐胨水培养基： 3 支 *5ml/ 支 明胶培养基： 5ml/ 支 *3 支 第二次 供试液及増菌液的制备 供试液的制备 取供试液 10ml，加入 Ph7.0 无菌氯化钠溶液 - 蛋白胨缓冲液 90ml，混匀，制成 1： 10 供试 液。 稀释倾注培养基 将供试液倾注入已加稀释液的无菌平板， 每个稀释度注 2 个平皿， 每个平皿约 15-20ml ，将 供试液和培养基混匀，放置，待凝。 取亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基） 3 份，每份 100ml，分别加入 10ml 供试 液， 10ml 供试液及 0.2ml 对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。 置于 37℃环境下培养 24-48h 。 取四六磺酸钠绿亮培养基（ TYB 増菌液） 3 份，每份 100ml ，分别加入 10ml 供试液， 10ml 供试液及 0.2ml 对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于 ℃ 环境下培养 取胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂） 3 份，每份 100ml ，分别加入 10ml 供 试液， 10ml 供试液及 0.2ml 对照菌液做阳性对照， 与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。 置于 37℃环境下培养 18-24h 第三次 分离培养 将上述各种供试品培养液轻轻摇动，以接种环沾取 1~2 环培养液划线至下类各种培养基 培养基种类 细菌种类 卵黄高盐琼脂培养基 （或 TMB 金黄色葡萄球菌 培养基或血琼脂平板） 十六烷三甲基溴化铵平板 绿脓杆菌 胆盐硫乳琼脂培养基（或沙 沙门氏菌 门氏、志贺菌属琼脂） 麦康凯琼脂培养基（或曙红 沙门氏菌 亚甲蓝琼脂培养基） 置于 37℃，培养 18~24h 第四次 金黄色葡萄球菌： 取金黄色葡萄球菌纯培养物，接种于甘露醇发酵管中，置于 37`C 培养 18~24h。【金黄色葡 萄球菌发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色） 】。 绿脓杆菌： 绿脓色素试验与硝酸盐还原试验 挑取分离的纯培养物分别接种于 PDP琼脂斜面，硝酸盐胨水培养基中，置 37℃培养 24h。 明胶液化试验 用接种针取疑似绿脓杆菌菌落，穿刺接种于明胶培养基内，置 37℃培养 24h。 42℃生长试验 挑取纯培养物，接种在营养琼脂斜面培养基上，置 42℃水浴中培养 24～ 48h， 沙门氏菌： 脲酶试验：取菌种接种于脲琼脂培养基斜面，置于 37℃培养 18～ 24h 动力试验：穿刺接种于半固体营养琼脂培养基，置于 37℃培养 18～