EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白).docVIP

三、凝胶滞留试验（EMSA） 凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。 （一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化 以GST标签为例。 裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM Na2EDTA、1mM DTT和1×Complete Protease InhibitorCocktail。 洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2EDTA、1mM DTT和1×Complete Protease InhibitorCocktail。 1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。 2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。 3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。 4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心15 min，收集菌体并称重。 5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。 6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。 7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45μm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。 8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂。 9 待裂解液流到树脂上沿以下时，加入已过滤的菌体裂解液。流出液再过一次树脂，收集流穿液。 10 用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集洗涤液并置于冰上。 11 用5倍树脂体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋洗脱液置于冰上。 12 洗脱结束后，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集清洗液置于冰上。 13 用5倍树脂体积的双蒸水洗涤树脂，树脂保存于3倍体积的20%（v/v）乙醇中。 14 通过SDS电泳分析流穿液、洗涤液、目的蛋洗脱液和清洗液中出现的目的蛋白。 15 用截留分子量不大于目的蛋白分子量1/3的超滤管超滤纯化目的蛋白，并加入透析液继续超滤至合适的体积，转移到1.5 mL离心管中，-20℃保存。 （二）蛋白质浓度的BCA法测定 用Thermo Fisher公司生产的BCA蛋白定量分析试剂盒测量蛋白质溶液的浓度。 1用透析液稀释2000 μg mL-1标准蛋白质溶液，得到浓度分别为0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 μg mL-1 的标准蛋白质溶液。 2A液与B液按50：1的体积混匀，得到WR液。 3将200 μL WR液分别与25μL不同浓度的标准蛋白质溶液混匀，封口，37℃温育30min。 4冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。做出标准曲线。 5将25μL待测蛋白质溶液加到200 μL WR液中，混匀，封口，37℃温育30min。 6冷却至室温后测量562nm波长的吸光值，测3次，取平均值。根据标准曲线得出待测蛋白质溶液中的蛋白质浓度。 （三）转录因子直接结合DNA的EMSA验证 用Thermo Scientific公司生产的Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module检测生物素标记探针。 1配制6%非变性PAGE凝胶：1800 μL双蒸水、3500 μL 1×TBE缓冲液（50 mM Tris-硼酸和2 mM Na2EDTA）、1400 μL 30%（w/v）Acr/Bis（29：1）、219 μL 80%（v/v）甘油、52.5 μL 10%（w/v）APS和3.5 μL TEMED。 2配制4×结合缓冲液：200 mM pH 8.0Tris-HCl、4 mM Na2EDTA、600 mM KCl、4 mM DTT； 3配制结合反应液：5 μL 4×结合缓冲液、1 μL poly（dI·dC）、5 μg纯化蛋白和0.1 pM生物素标记探针，用双