2020淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成实验.pptVIP

实验五淋巴细胞分离与 E 玫 瑰花环形成实验 实验目的 ? 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （ PBMC ）的分离方法 ? 学习 E 花环试验的操作方法 ? 观察显微镜下 E 花环的形态 实验原理 ? 淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体 免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还 可以用于 E 花环试验、淋巴细胞转化试验 及淋巴细胞培养（需无菌操作）。 ? 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原 则是收率较高，纯度较好，失活较低。无 论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应 有活性。 实验原理 ? 分离的技术可根据细胞的物理性状和表 面标志设计，根据不同实验目的可采用 密度梯度离心法、吸附分离法和其它特 殊分离法。 实验原理 ? 本实验采用的是密度梯度离心法。该方 法是根据各类血细胞比重的差异（ 外周 血中各种细胞的密度不同，人红细胞密 度为 1.093 ，粒细胞为 1.092 ，淋巴细胞为 1.074 ± 0.001 ），利用比重介于某两类细 胞之间的细胞分离液对血液离心，使一 定比重的血细胞依相应的密度梯度分布 于不同的独立带，从而达到分离的目的。 实验原理 ? 人 T 淋巴细胞表面的 CD2 分子即绵羊红细 胞受体（ ER ），在一定的实验条件下， 可与绵羊红细胞（ SRBC ）结合，形成玫 瑰花结，称为 E 玫瑰花环试验 (erythrocyte- roseette formation test) 。 ? 该试验常用于临床检测人外周血 T 淋巴细 胞的数量和比例，由此可间接反映机体 的细胞免疫功能状况。 实验原理 T 细胞 SRBC SRBC 受体 实验器材 ? 注射器、刻度吸管、毛细吸管、 玻片、 试管、 离心管 ? 肝素、无 Ca 、 Mg 的 Hanks 液、淋巴细胞 分离液、 双蒸水、生理盐水、 0.8% 戊二 醛、 瑞氏染液 ? 绵羊红细胞悬液 （鸡红细胞悬液） 、 ? 离心机、水浴箱、显微镜等。 实验步骤 1. 取 1ml 豚鼠肝素抗凝血 于试管中，加等量 Hanks 液稀释，手动轻轻摇匀； 2. 取 2ml 淋巴细胞分离液加入 15 ml 离心管中； 3. 用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁 缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 4. 室温下立即置水平式离心机以 2000rpm 离心 20 分钟， 离心后分为 4 层 。 5. 用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处 单个 核细胞 （ PBMC ）层至一刻度离心管内。 6. 加入 5 倍以上体积的 Hanks 液洗涤 3 次，每次以 2000rpm 离心 10 分钟，弃上清，沉淀主要为单 个核细胞） 。 豚鼠背足静脉取血 ? 一人抓住豚鼠，将其左或右后肢膝关节 伸直； ? 另一人消毒豚鼠的脚背面并找出背中足 静脉，以左手的拇指和食指拉住其趾端； ? 右手持注射器刺入静脉，徐徐抽取血液， 达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压 迫止血。 离心 稀释的血液 分离液 稀释的血浆 单个核细胞 分层液 粒细胞、红细胞 ? 外周血单个核细胞（ PBMC ）主要指 T 、 B 淋巴细胞、 NK 细胞和单核细胞，是免 疫学实验中最常用的细胞群， PBMC 的分 离也是进行 T 细胞和 B 细胞分离纯化的重 要中间环节 。