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? 凝胶过滤层析法 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质分离纯化及鉴定 凝胶过滤层析法 1. 试验原理 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根 据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 凝胶层析的原理 K d =(V e -V o )/V i 优点 a. 条件温和 b. 操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 2. 凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 a. Sephadex: 交联葡聚糖 G-10 ， 15 ， 25 ， 50 ， 75 ， 100 ， 150 ， 200 ；得水值 X 10 b. Sepharose ：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A c. Bio-Gel P ：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 d. Sephacryl ：用 N ， N- 亚甲双丙烯酰胺交联 的葡聚糖凝胶 凝胶柱的选择 3. 凝胶的前处理 a. 溶胀： 称取适量凝胶干粉，用约 10 倍蒸馏水 浸泡 24 小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去 上层悬浮物及蒸馏水。 b. 碱洗： 用 0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 c. 酸洗： 用 0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后 用蒸馏水洗至中性。 d. 平衡： 用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液 pH 与起始缓冲液相同。 a. 将层析柱垂直固定，加入适 量溶剂排走空气。 b. 将平衡好的凝胶搅匀，连续 倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3 高时打开下端出口， 让溶剂慢慢流出，继续侵入 凝胶至沉降到所需高度。装 柱时要注意操作压。 c. 用 3-5 倍柱床体积的起始缓冲 液走柱，使交换剂充分平衡， 柱床稳定。 4. 装柱 5. 样品上柱、洗脱、 收集。 a. 如图装好层析装置，打开下端出 口，使溶液流出至刚好达到凝胶 胶面 b. 沿柱壁缓慢加入 2ml 样品，打开下 端出口，使样品溶液流出至刚好 达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁。 c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收 集，合并同一高峰各管。 6. 凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经 0.5M 的 NaOH 和 HCl 溶 液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02% 叠氮钠 或 0.002% 双氯苯双胍己烷 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定 应用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 ． 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 ( 简称 Acr) 和交联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 ( 简称 Bis) 在 加速剂 N ， N ， N ? ， N ? - 四甲基乙二胺 ( 简称 TEMED) 和催化剂过硫酸铵 ( 简称 AP) 或核黄素 (V B2 ) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝 胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺 凝胶电泳 ( 简称 PAGE) 。 1.1 聚丙烯酰胺凝胶优点 1) 化学性能稳定，对 pH 和温度变化不敏感； 2) 重复性好； 3) 灵敏度高，可达 10-6 g ； 4) 分辨率高。 分子量范围 适用的凝胶浓度 /(%) ? 10 4 20-30 1-4 × 10 4 15-20 1-5 × 10 4 -1 × 10 5 10-15 1 × 10 5 5-10 ? 5 × 10 5 2-5 分子量范围与凝胶浓度的关系 1.2 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 1.3 种类 1) 连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳 ( 图 1) 和 板状电泳 ( 图 2) ，两者电泳原理完全相同。 2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。 图 1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面 ,B 为剖面 ) (1) 样品胶 pH 6.7 (2) 浓缩胶 pH 6.7 (3) 分离胶 pH 8.9 (4) 电极缓冲液 pH 8.3 图 2 夹心垂直板电泳槽示意图 1. 样品槽模板 2. 长玻璃