实验七连续记录法测定过氧化氢酶的活力.docxVIP

一 . 目的 了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法 掌握 简易凝胶层析 与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算 二 . 原理 过氧化氢酶（ Catalase， CAT ， EC ，其催化的反应为： 通过上述反应， CAT 可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平，减少自由基和过氧 化脂质的形成，对生物体起重要的保护作用。 传统测定 CAT 活力（活性）的方法有滴定法和测压法，但这两种方法不仅误差较大，且 比较复杂。 本实验采用 紫外分光连续记录测定法 ，具有操作简单， 灵敏度高， 结果直观的优 点。 测定时，酶反应在紫外分光光度计的 石英比色皿 中进行，分光光度计与记录仪相连接， 由于 H2O2 在 240nm 处有吸收峰，加入酶液后会使 A 240 下降，而 A 240 下降的情况又可以记 录在纸上， 从记录的初始直线段计算 A240 的变化速率 DA 240·min -1，最后根据酶液体积和样 品鲜重可以直接算出 DA240·min-1 · g-1Fw 并以此来表示样品中 CAT 活力的大小。 . 实验材料及设备 材料 小麦叶片（或其它禾本科植物叶片） 仪器 电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计 器材 析 柱： 1 套 刻度试管： 5mL×10 移 液 管： 5mL×1 微量进样器： 1000ml ×1 200ml ×1 （可调） 塑料离心管： 7mL×1 小 试 管： 1 支 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 硫 酸 纸 1 研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1 . 试剂的配制 提取缓冲液（ 0.05mol/L 、 pH7.0 PBS ，内含 l%PVP ） CAT 反应液 (0.05mol/L 、 pH7.0 PBS ，内含 0.015mol/L H2O2) 层析介质： Sephadex G-25 五 . 操作步骤 粗酶液的制备 取材：称取 0.5g 左右的生物材料，记下实际质量。 研磨：将样品剪碎于研钵中，加入预冷的提取缓冲液 5mL ，置冰浴上充分研磨。 （如不易研磨，加少量石英砂。） (3) 离心：匀浆液全部转入 7mL 塑料离心管，平衡后于 4℃下、以 10,000g 离心 10 分钟。 上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为粗酶液，置于冰浴中备用。 粗酶液的初步纯化 （ 1）上样：用可调微量进样器或移液管吸取 1mL 粗酶液过 Sphadex G-25 小柱（总床体 7mL ）（参照 “凝胶层析脱盐 ”实验的上样步骤）。 （ 2）收集：每管收 2mL ，共收集 4 支试管，然后关闭出口。 3）检测：将收集到的洗脱液每管取 0.4mL 到相应的另一支空试管中， 用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质 。 4）合并：将检测到 含有蛋白质的对应的几支管等体积混合 ，摇匀，即为初步纯化的粗酶液，置于冰浴中备用。 3. 酶活力测定 (1) 紫外分光光度计与记录仪相连接， 波长定于 240nm 处，记录仪的量程定于 50mV 处， 预热 10min ，仪器调零。 在光径为 1cm 的石英比色皿内， 先加入 3mL CAT 反应液， 再加 0.1mL 的粗酶液或初 步纯化的粗酶液后（视酶活力大小而定） ，用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀数次 （不要过 分剧烈颠倒）；立即把石英比色皿插入比色架上，关盖，同时将记录仪的纸速开关拨至 4mm/min 处， A 240 的变化情况被记录于纸上。 3min 后关闭纸速开关。 重复步骤（ 2），再测定 1～ 2 次。 . 结果处理 在记录纸上取实验记录得到的直线一段，计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值， A 240·min -1，（记录纸的纵轴为时间分钟，横轴为光吸收 A240 ），该余切值代表酶反应的初速度，最后取重复测定的平均值； 根据活力测定的酶液加入量、 酶液总体积和样品鲜重， 计算植物样品中 CAT 活力， 以 2 A 240·min -1 · g-1Fw 表示（包括粗酶液与初步纯化的粗酶液）。 . 思考题 什么是酶反应进程曲线？它对酶活力测定有何意义？ 什么是酶浓度曲线？它对酶活力测定有何意义？ 粗酶液与初步纯化过的粗酶液过氧化氢酶活力哪个大？为什么？如果要计算纯化倍数，还应该做哪些工作，并如何计算？ 3