转思路迪博客:慢病毒载体发展.docxVIP

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转思路迪博客:慢病毒载体发展 和“简单型”逆转录病毒载体的设计类似,对慢病毒载 体的改造也是基于将其病毒基因组分成三个载体分别表达 包膜蛋白,病毒包装蛋白和外源表达载体。当使用慢病毒载 体用于临床基因治疗时,有些系统甚至使用 4 或者 5 质粒系 统以降低产生复制性病毒 (RCR, replicative-competent retrovirus) 的可能性从而增加体内使用的安全性。 与“简单型” 逆转录病毒不同的是,慢病毒由于存在辅助蛋白和调控蛋 白,其载体改造涉及更多的对这些反式作用因子的去除以及 相应的顺式作用元件的改造。第一代慢病毒载体使用三质粒 系统,将包膜蛋白单独置于一个质粒中表达,包装载体含有 除包膜蛋白编码基因的全病毒基因组,使用 CMV 启动基因 表达,并用人胰岛素基因的 polyA 替代 3 LTR 作为加尾信 号,同时将外源插入片段以及所有相关顺式作用元件 (包装信 号 y, LTRs,RRE 和引发结合位点 (PBS, primer binding site)) 置于外源表达载体中。第二代慢病毒载体去除了辅助蛋白编 码基因Vif, Vpr, Vpu和Nef,以减少产生 RCR的风险。第 三代慢病毒载体则去除了对 Tat和Rev蛋白因子的依赖作用。 通过将5 LTR中的U3区替换成CMV,可以消除对 Tat的 依赖;通过对 gag-pol 编码基因的密码子进行优化,可以解 除对 Rev 的依赖。 许多顺式作用元件 (DNA 序列)对病毒的包 装效率影响也很大, 比如 cPPT 和来源于 Igk 的 MAR (matrix attachment region),以及 WPRE( 土拨鼠乙肝病毒转录后调控 元件 ),其可以有效帮助 mRNA 的 polyA 加尾效率。同时通 过失活 3LTR 区的 U3 区,可以减少病毒载体整合后对宿 主整合位点附近基因的表达干扰,而且还可以有助于引入诱 导表达或者组织特异性表达系统。 包膜蛋白表达载体:慢 病毒载体改造中一个重大突破是将慢病毒自身的包膜蛋白 替换成其它病毒的包膜蛋白,尤其是 VSV-G 。 VSV-G 包膜 蛋白赋予慢病毒载体三个非常重要的特性: 1),稳定慢病毒 载体颗粒,使得其可以承受超离心的剪切力,因此可以进行 浓缩,从而可以获得超高滴度 (1011IU/ml) 以用于体内实验 (动 物实验和基因治疗 );2),其受体为细胞膜上的磷脂酰丝氨酸 分子,因此极大拓展慢病毒载体的侵染谱系; 3),介导慢病 毒载体进入胞吞途径,从而使得整个侵染整合过程减少了对 慢病毒自身辅助蛋白的依赖。 当然, VSV-G 蛋白也有一些缺 点: 1),用于动物体内实验时,有报道出现针对 VSV-G 蛋白 的补体和抗体介导的免疫反应从而阻碍慢病毒载体的功能 发挥; 2),体内少数组织,比如气管上皮细胞的顶端面缺乏 VSV-G 受体,因此携有 VSV-G 的慢病毒载体在体内对其侵 染性极低。通过使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解决这个问 题,从而使得囊性纤维化疾病的基因治疗 (其主要靶底是气管 组织 )成为可能。 因此, 显然为了进一步拓展慢病毒载体的侵 染范围,需要开发和优化更多的包膜蛋白。 包装因子表达 载体: 去除辅助蛋白因子包装因子表达载体表达除包膜蛋 白外的所有包装和侵染必须的反式作用因子。为避免将此类 序列包装入假病毒颗粒 (慢病毒载体 ),因此包装因子表达载 体上缺乏顺式包装信号 y 和 LTR 序列,然而仍然保留 Rev 响应元件(RRE , Rev response element)序列和剪切供体位点。 使用其它启动子, 比如 CMV 或者 RSV 启动子, 以及胰岛素 基因的 polyA 加尾信号序列替代 LTR 的对应序列, 可以使得 转录产物更加稳定,表达效率更高。 和“简单型”逆转录 病毒载体不同的是,除 Gag, Pol 和 Env 之外,慢病毒还表 达有其它 6个蛋白因子,包括 Vpu、Vpr、Vif、Nef 辅助蛋 白和 Tat、Rev 调节蛋白。 这些蛋白是 HIV-1 在体内实现高速 复制所必须的因子, 同时还决定了 HIV 的病原性。 某些感染 HIV 的病人其存活期非常长, 是因为其感染的 HIV 属于缺乏 这一类辅助蛋白的病毒株。而且, HIV 的体外复制可以不需 要Vpu、Vpr、Vif、Nef辅助蛋白的参与。因此,研究人员 通过去除这些辅助蛋白,可以达到即提高安全性又不影响病 毒体外辅助的目的。第一代慢病毒载体仍然含有这些辅助蛋 白编码基因。第二代慢病毒载体去除了所有 4个辅助蛋白编 码基因,但仍然保留有 Tat和Rev基因。第三代慢病毒载体 去除了 Tag基因,并将Gag-Pol和Rev分在两个质粒载体中 表达。这些改造,极大降低了重组

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