荧光定量实验方法操作基础手册.docVIP

Stratagene定量PCR仪标准曲线制作方法 定量PCR定量基础原理就是用已知拷贝数梯度稀释样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品量。不管是在基因表示分析试验还是在病原微生物检测应用中全部有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。 标准样品准备 1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品拷贝数。对于这类试验标准品是经过某种方法制备得到已知拷贝数含有目标片段核苷酸序列。最常见是插入有目标序列质粒，因为质粒是环状DNA有较强稳定性，而且分子量比较大定量时候比较正确。也有用线状PCR产物作为标准品，通常要比扩增目标片段要大部分，这也是为了取得分子量比较大片段，提升拷贝数正确性。标准品拷贝数是经过紫外定量方法来确定，先得到标准品浓度C(ng/uL)，因为不管是质粒还是PCR产物它们序列全部是已知，这么经过核苷酸相对分子量和标准品序列信息估算出标准品分子量B，则标准品拷贝数A(copy/uL) 为： A=C/B×6.02E+14 2、相对定量。关键是针对基因表示分析试验而来，因为要知道全部是相正确数值（对照样品和试验样品中基因表示比值），这么就不需要知道正确拷贝数，所以标准品也就无须知道正确拷贝数，只需知道稀释倍数就能够了。 试验中标准品能够是起源比较丰富细胞或组织RNA转录得到cDNA。将这种cDNA进行梯度稀释，能够是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体试验要依据具体情况来调整稀释倍数。最好能作一个预试验来看看什么样稀释倍数比较适合这种基因扩增）。而对于各个稀释倍数要对它拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有基因数量，当然在基因表示分析中也不需要，而是要求依据稀释倍数给每一个稀释度人为给予拷贝数，这只是为了方便试验最终止果计算而已。比如能够把前面稀释十倍样品赋值为10000个拷贝，100倍赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍赋为10等。要注意，赋值数目标倍数差异和稀释倍数应该是一样，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍改变。 怎样做标准曲线 在定量试验中标准品是要和未知样品一起进行定量试验，这么在试验结束，不管是标准品还是未知样品全部将跑出曲线，取得了Ct值。那么先能够把未知样品放到一边，对于标准品来说，既取得了Ct值，还知道她们拷贝数（即使对于相对定量来说这个拷贝数是我们自己给予）。这么能够经过标准品Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品Ct值知道（经过试验求得），这时候就在标准曲线上进行定位，就能够得到未知样品拷贝数了。 实际上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，和标准品拷贝数等必需信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品拷贝数计算出来了。 举例来说怎样进行设置 1、优异入软件，在板设置中选择所放样品位置，并标上unknow或standard等信息。 2、选择要使用荧光染料。 3、设置复孔。 假如有些孔有反复就用用样数字标明，这么仪器就知道哪些是反复，最终止果处理话也能够取平均等操作。 有相同标号系统就认为是一样样品反复。 4、标准品赋值 接下来要给标准品赋上值，系统要知道根据什么去计算 标准品赋值要先选上要赋值标准品，然后在工具面板中输入对应值。 自动增加稀释倍数填入标准品量 自动增加稀释倍数 填入标准品量 为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数设置，点开后就能够选择你稀释倍数，然后用鼠标去选择孔时候会自动增加 选择稀释倍数 每次选择不一样孔，在里面赋值会自动根据倍数增加 5、设置温度 在这里提供一个对于SYBR染料常见温度控制模板，能够参考。注意最终溶解曲线制作过程在升温过程中选择标有all放大镜，代表从55℃到95 6、设好了以后能够运行程序了，最终标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品拷贝数。 Stratagene荧光定量PCR仪基因表示分析处理方案 Stratagene荧光定量PCR仪和配套Mxpro软件在处理基因表示分析方面功效比较强大，下面简明说明怎样使用该软件来进行基因表示分析。 比如要分析IL1基因表示情况，用看家基因GAPDH作为内参，采取是SYBR GreenI染料法。 1、板设置 1.1、专门基因表示分析试验模式。打开Mxpro程序操作窗口，首先弹出对话框是要用户选择要进行试验类型，做基因表示分析能够选择第二项Comparative Quantitation (Calibrator)。 1.2、方便类型选择和孔设定。在板设置中选择样品类型，能够将样品名称写成GAPDH和IL1，并将GAPDH设为看家基因（NORM），这么设置很清楚，有利于分析结果。假如试验中使用了复孔，则在复孔上标上相同数字，代表这些样品是反复，下图中每个样品反复三次。