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聚焦过程中出现的问题及解决办法 一、 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦不论在制胶、 电泳和染色过程中都比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS电 泳有较多的技术问题需要解决，如制胶不易聚合，电泳时易烧胶，脱色时背景不易脱净等。但是只要 掌握等电聚焦技术的原理，就能解决这些问题而得到高分辨和满意的结果。 1. 凝胶聚合不佳，胶软，粘 1） 系统中使用的试剂和水不纯（应该用双蒸水配制溶液） 。 2 ） 系统中有醇、巯基化合物或灰尘影响聚合。 3 ） 凝胶浓度和关联度太低（有时是由于丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺溶解不佳造成的） 。 4 ） 过硫酸铵（粉末或溶液）和 TEMED 保存期太长，不能起催化作用。 5 ） 贮液保存期太长，抽气不充分。 6 ） 聚合时温度太低，最好在 30~40 ℃聚合。 7 ） 如用核黄素催化的光聚合， 应使用近紫外的光源， 如荧光灯， 不要用钨灯泡， 并采用尽可能薄的玻璃， 不要用塑料板。 8 ） 核黄素在碱性 pH 范围不能催化光聚合。 2. 接通电源后没有电流，电流太低或电流随电泳增加 1） 如果接通电源后没有电流， 也没有电压， 应检查外线电源是否正常工作？电源的保险丝是否完好？电 源和电泳槽的连接插头是否已插好？ 2 ） 如果仅仅没有电流或电流很小，应检查凝胶、电极条与电极之间的接触是否良好？ 3 ） 检查电极条上的电极液是否充分？ 4 ） 如果在等电聚焦过程中，电压逐渐下降，电流逐渐上升，应检查电极或电极液是否阴、阳极错置？ 3. 接通电源后电流太高或在电泳过程中电流突然升高 1） 电流太高通常是由于在凝胶或样品中有过量的盐。 2 ） 电流突然升高是烧胶（原因下述）的前奏，应立即关掉电源。 4. 等电聚焦过程中冷凝水的出现 等电聚焦过程中出现冷凝水虽然是常见现象，但它是烧胶的征兆，所以应予密切注意。 1） 如果在整块胶面上出现冷凝水是由于功率（电压）设置太高或由于冷却不充分。应重新设置温度，检 查循环冷却水的运行，凝胶与冷却板的接触。在夏天时，冷却温度不要设置太低，以免潮湿空气凝聚 在凝胶周围。 2 ） 在加样上方出现冷凝水，说明加样过多或样品中有盐。 3 ） 电极沿边的冷凝水常常是由于过多，过浓的电极液造成的，有时还因此而引起在凝胶上的压痕。 4 ） 在凝胶的碱性侧或阴极沿边出现冷凝水通常是由于凝胶介质的电内渗引起的。 5 ） 在凝胶的部分位置出现冷凝水是由于凝胶与冷却板之间有气泡，接触不好。 6 ） 如果在凝胶上一条线区域出现冷凝水可能是由于载体两性电解质在此 pH 范围的导电性不佳引起的， 特 别是使用窄 pH 范围的电解质，过长的聚焦时间可能也是原因。 5. 打火花和烧胶 凝胶上出现冷凝水是打火花和烧胶的前奏，所以要避免冷凝水的出现。 1） 如果烧胶是沿着电极条边缘，可能是由于电极条太长。电极条应比凝胶短几毫米。 、 2 ） 如果烧胶是沿着阴极条边缘，可能是由于凝胶介质较长时间与碱性电极液接触而水解。如果样品数目 多，最好先加样，后加阴极电极条。 3 ） 如果在 pH7 纯水区烧胶，应在制胶时加适量 pH3~10 或 pH6~8 的载体两性电解质。 6. 不能得到预期的 pH 梯度 1） 电泳过程中产生梯度漂移，也称平台现象，可能是由于介质中丙烯酸引起阴极漂移所致。 2 ） 单体贮液时间太长。 3 ） 聚焦时间太长。 4 ） 载体两性电解质导电性不均匀。 7. pH 梯度的碱性部分被丢失 1） 凝胶溶液吸收了大气中的二氧化碳。 2 ） 凝胶介质的电内渗。 3 ） 在电泳时，载体两性电解质和电极液被氧化。 8. pH 梯度成波纹状 1） 凝胶聚合时加过多的过硫酸铵。 2 ） 电极液保存时间太长，电极液太多，不均匀。 3 ） 凝胶，电极条，电极液接触不好。 4 ） 电极丝不直或不干净。 5 ） 尿素胶贮存时间太长。 6 ） 如果波纹主要在加样位置，说明蛋白浓度太高或样品中有较高浓度的盐。 9. 蛋白带的拖尾和纹理现象 1） 样品溶解不好，有沉淀颗粒。 2 ） 加样器或加样滤纸片