测定蛋白质相对分子质量的常见方法及其优缺点.ppt

测定蛋白质相对分子质量的常用方法及其优缺点 周一3组 钱翀王玉阁 常用方法 渗透压法 粘度法 光散射法 凝胶过滤层析 SDS-凝胶电泳 超速离心沉降法 电喷雾离子化质谱 基质辅助激光解吸电离质谱 凝胶过滤层析法 (GFC) 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。 层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖类物质（如葡聚糖或琼脂糖） ，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 凝胶过滤层析法 通过凝胶柱, 大分子物质与小分子物质得到分离。自加入样品时算起, 至组分最大浓度( 峰) 出现时所流出的体积称为“ 洗脱体积” , 以Ve表示。 凝胶装柱后, 柱床所占体积称为总体积，以Vt表示。 Vo称为“ 空隙体积” 或“ 外体积” , 即柱床内存在于凝胶外面的水相的体积。 定义Kav 为有效的分配系数，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。 凝胶过滤层析法 对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：  Ve=K1—K2logMr K1与K2为常数，Mr为分子量，Ve也可用Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化的洗脱体积）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。 凝胶过滤层析法 通常多以Kav对分子量的对数作图, 得到一条直线,称为“ 选择曲线”。 每一类型的化合物(如球蛋白类、右旋糖酐类等) 有其特殊的选择曲线, 可用以测定未知物的分子量。测定时以使用曲线的直线部分为宜。 球蛋白分子量选择曲线 凝胶过滤层析法 操作方便，设备简单，样品用量少，周期短，重复性能好，条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，而且有时不需要纯物质，粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。 凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。 糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。 SDS-凝胶电泳法 SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷。 带上的负电荷数量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素。 SDS-凝胶电泳法 带电粒子在单位时间内移动的距离称为电泳迁移率。 溶液中带电粒子在电场(E)中向着与它相异电荷的电极移动，它的移动速度(V)是电场(E)和粒子的有效迁移率(m)的乘积，V＝mE 一般情况下电泳中蛋白质分子量对数与迁移率呈线性关系，具体由凝胶的情况决定 。 SDS-凝胶电泳法 实验成本较低，仪器设备也相对简单 对pH和温度变化较稳定 几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好 精确程度相对较低 * * 凝胶过滤法，周同惠，《国外医学参考资料·药学分册》[J]，1974,1. Analytical Ultracentrifugation (AUC) sedimentation velocity sedimentation equilibrium Analytical Ultracentrifugation (AUC) Svedberg equation sedimentation velocity Picture from the Internet Lamm equation Rearrange Analytical Ultracentrifugation (AUC) sedimentation equilibrium Svedberg equation /wiki/Lamm_equation Beckman Optima XL-A Analytical Ultracentrifuge Picture from the Internet Advantages Disadvantages Low expense Simple equipment Easily be affected Some constants in equati