油菜NsaCMS不育基因的鉴定及败育机理解析.pdfVIP

甘蓝型油菜Nsa CMS 不育基因的鉴定及败育机理解析 目 录 摘要 1 ABSTRACT 3 缩略表 6 1 前言 7 1.1 细胞质雄性不育类型 8 1.1.1 孢子体不育与配子体不育 8 1.1.2 细胞质来源 9 1.2 细胞质雄性不育基因的特征及鉴定方法 11 1.2.1 不育基因的特征 11 1.2.2 表达分析鉴定不育基因 15 1.2.3 遗传转化验证 15 1.3 细胞质雄性不育机理研究进展 19 1.4 课题由来 21 1.5 研究的目的和意义 21 2 材料方法 22 2.1 植物材料 22 2.2 表达载体和菌株 23 2.3 实验方法 23 2.3.1 植物材料DNA 提取 23 2.2.2 RNA 的提取 23 2.2.3 cDNA 一链合成 23 2.2.4 线粒体基因荧光定量分析 24 2.2.5 RNA 印记（Northern Blot ）分析 25 2.2.6 原核表达分析 25 2.2.7 活性氧（ROS ）检测 27 2.2.8 亚细胞定位 28 2.2.9 遗传载体构建及转化实验 28 2.2.10 转录组分析 29 2.2.11 电镜半薄切片观察 29 2.2.12 基因及基因的组分析 29 3 结果 30 3.1 油菜Nsa CMS 不育系的表型及细胞学观察 30 3.1.1 油菜Nsa CMS 不育系表型观察 30 3.1.2 油菜Nsa CMS 不育系的败育时期观察 32 3.2 Nsa CMS 线粒体基因组组成分析 32 3.2.1 线粒体基因组共线性分析 32 3.2.2 Nsa CMS 功能基因来源分析 34 3.2.3 Nsa CMS 多种线粒体单倍型（mitotype ）分析 35 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位（毕业）论文 3.2.4 Nsa CMS 线粒体基因组进化分析37 3.2.4 Nsa CMS 与保持系中差异开放阅读框的鉴定38 3.3 Nsa CMS 不育关联基因的鉴定39 3.3.2 候选不育基因的RT-PCR 鉴定41 3.3.3 候选不育基因的进化分析43 3.3.3 Northern Blot 分析候选不育基因的表达44 3.3.4 候选不育基因的毒性分析44 3.3.5 三个候选不育基因遗传转化分析45 3.4 orf346 基因研究及标记开发52 3.4.1 orf346 同nad3 和rps12 共转录52 3.4.2 ORF346 的亚细胞定位53 3.4.3 orf346 表达对大肠杆菌致毒性研究54 3.4.4 orf346 与活性氧之间的关系58 3.4.5 orf346 导致ATP 生成减少59 3.4.6 orf346 对油菜基因表达的影响分析62 3.4.7 orf346 标记开发62 3.5 Nsa CMS 败育机理研究64 3.5.1 Nsa CMS 败育同活性氧之间的关系65 3.5.2 Nsa CMS 同激素之间的关系66 3.5.3 Nsa CMS 败育同线粒体功能基因表达之间的关系67 3.5.4 Nsa CMS 同保持系功能基因的差异分析69 3.5.5 Nsa CMS 转录组分析70 4 讨论79 4.1 Nsa CMS 线粒体基因组组成79 4.2 orf346 为Nsa CMS 的不育基因8