奶牛妊娠外泌体miRNA表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究.pdfVIP

奶牛妊娠外泌体miRNA 表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究 目 录 摘 要 I ABSTRACT VI 缩略词表（ABBREVIATIONS ） XII 第一章 外泌体和妊娠免疫及其关联研究进展 14 1. 前言 14 2. 外泌体及其生成 15 2.1 外泌体的发现 15 2.2 外泌体分泌机制 16 2.3 外泌体介导细胞间通讯 18 2.4 外泌体miRNA 分拣机制20 3. 外泌体与妊娠调节22 3.1 胎盘外泌体23 3.2 胎盘外泌体与妊娠免疫25 3.3 胎盘外泌体与妊娠疾病26 4. 子宫免疫微环境平衡及其相关分子机制27 4.1 Th1/Th2 细胞因子27 4.2 经典NF-κB 炎症信号通路与妊娠子宫免疫微环境调节29 4.3 miRNA 、NF-κB 以及妊娠免疫31 5. 研究目的和意义33 第二章 奶牛各时期妊娠外泌体MIRNA 谱分析35 1. 前言35 2. 实验材料36 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位（毕业）论文 2.1 血浆样本采集36 2.2 主要仪器设备36 2.3 主要试剂37 2.4 主要数据分析软件39 3. 实验方法40 3.1 血浆中外泌体的分离40 3.2 外泌体鉴定40 3.3 外泌体浓度测定42 3.4 胎盘外泌体浓度测定（ELISA 法）42 3.5 外泌体总RNA 提取（试剂盒法）43 3.6 外泌体小RNA 文库构建及测序44 3.7 测序质量评估45 3.8 序列比对以及miRNA 注释45 3.9 差异miRNA 分析46 3.10. 差异miRNA 靶基因预测以及GO/KEGG 通路富集分析46 3.11 cDNA 制备与荧光定量PCR 47 4. 数据统计与分析49 5. 结果与分析49 5.1 外泌体鉴定49 5.2 差异miRNA 分析51 5.3 各组差异miRNA 预测靶基因GO 功能注释53 5.4 各组差异miRNA 预测靶基因KEGG 通路注释54 II 奶牛妊娠外泌体miRNA 表达谱分析及其对早期子宫免疫微环境的调控机制研究 5.5 荧光定量PCR 56 6. 讨论57 6.1 血液循环中的胎盘外泌体57 6.2 外泌体miRNA——疾病指示分子58 6.3 妊娠期特异性外泌体miRNAs 58 7. 小结59 第三章 早期妊娠外泌体对子宫免疫微环境调控的机制研究60 1. 前言60 2. 实验材料61 2.1 主要仪器设备61 2.2 主要试剂63 2.3 主要数据分析软件66 3. 实验方法67 3.1 外泌体提取与鉴定67 3.2 外泌体miRNA 提取67 3.3 外泌体摄取实验67 3.4 cDNA 制备与荧光定量PCR 68 3.5 双荧光素酶报告实验71 3.6 重组DNA 转化72 3.7 重组质粒鉴定72 3.8 重组质粒大量抽提（试剂盒法）73 3.9 重组质粒和miRNA 转染74 III 华中农业大学2020 届博士研究生学位（毕业）论文 3.10 双荧光素酶报告系统检