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免疫细胞研究wester n blot Western Blot常见问题及处理总结 阿木 1、western blot 的优点 答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理 论上可达pg级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？ 答:原因有很多：a）你的细胞中不表达这 种蛋白质，换一种细胞；b）你的细胞中的 蛋白质被降解掉了，你必需加入 PMSF， 抑制蛋白酶活性；c）你的抗体不能识别目 标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很 清亮，为什么呢? 答：a）有沉淀可能因为你的蛋白没有变 性完全，可以适当提高SDS浓度，同时 将样品煮沸时间延长，b）也不排除你的 抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲 液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB ? 答:可以选择0.2卩m的膜，同时缩短转移 时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。 同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法? 答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改 变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗上 HRP催 化活力太强，同时你的显色底物处于一个 临界点，反应时间不长，将周围底物催化 完，形成了空白即反亮现象”将一抗和 二抗浓度降低，或更换新底物。 、我的胶片是一片空白，是怎么回事? 、我的胶片是一片空白，是怎么回事? 答：如果能够排除下面的几个问题那么问 题多半出现在一抗和抗原制备上。 a)二抗的HRP活性太强，将底物消耗 光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失 活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d): 抗失活 9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片，是什么原因呢？ 答：a）可能是红灯造成的,胶片本来就被 曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作. 看是否有改善.；b）显影时间过长。 10、DAB好还是ECM好？ 答: DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最 敏感的底物；ECM结果容易控制，但被 催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值， 就特别灵敏，可以检测pg级抗原。要看 你实验的情况。 11、抗原检测岀的分子量比资料上的大， 是怎么回事？ 答: a）抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇 量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。 b）蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等 12、 蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时 Marker转上去了，为什么？ 答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。 13、 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一 定要加NaF等？ 答: NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂， 一般最好加。但是不加也可以，大部分时 候是不用加的。 14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：① 免疫组化可以用来进行定位，但 是不能精确定量，而且有时会有假阳性， 不易与背景区分；Western blot可以特异 性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是 不能定位。 ②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。 15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存 （未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一 抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上 样量已加到120^g换了个santa cloz的 一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂 单加PMSF行吗？ 答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品 不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制 剂。同时，建议检查 Western Blot过程， 提咼一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 16、细胞水平要做 western blot，多少细胞提的蛋白够做 western blot ? 答：一般5X10A6就足够了17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对 western blot有无影响？ 答：能，没有问题 18、 18、 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗? 答：当然可以，有的甚至可以同时测几十 种样品。 19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋 白，操作需要注意什么？ 答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去 垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑 制磷酸化酶的活性。 20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不 到1微克，但是在转膜时经常会发现只有 一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染 胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是 颜色变淡了，有什么办法可以解