黄瓜花发育基因CsWIP1和CsPI的互作组分筛选.pdfVIP

摘 要 摘 要 黄瓜 （Cucumis sativus）是园艺生产中的重要蔬菜作物，也是雌雄异花植物性型 分化研究的经典模式植物，其花发育及性型分化是黄瓜生物学研究的重要问题。 CsWIP1 和CsPI 基因在黄瓜花发育过程，特别是在雌花发育中，有诱导雌蕊、抑制雄 蕊的重要作用。黄瓜CsWIP1 基因突变表现为雌全同株，植株所有节位的花中均有雌 蕊。另一方面，CsPI 基因的下调表达与黄瓜雌花中雄蕊的发育密切相关。然而，目前 针对CsWIP1 和CsPI 基因调控黄瓜花发育的机制尚不清楚，特别是转录因子CsWIP1 的互作组分和调控CsPI 基因的上游雌花发育相关因子还没有发现。本文通过构建黄 瓜顶芽cDNA 文库，以CsWIP1 构建双杂交诱饵质粒，以CsPI 的启动子片段构建单 杂交诱饵质粒，筛选与其有相互作用的成分，以期进一步阐述花发育基因调控性型分 化的机理，为完善性型分化网络图提供参考。经试验得到如下结论： 1、以黄瓜品种406 、406a 、GY14 、9930 为试验材料，混合其顶芽, 并提取混合 材料的总RNA ，利用SMARTTM 技术合成双链cDNA，产物经过柱纯化后，与线性化 处理的pGADT7-Rec 载体质粒共转化至Y187 酵母感受态菌株中，在亮氨酸 （LEU ） 缺陷型培养基上筛选出所有克隆，构建了黄瓜顶芽cDNA 文库。经检测该文库容量大 6 于2×10 cfu，文库的插入片段平均长度在1kb 左右，重组率为98%，为后续通过单杂 交和双杂交技术筛选互作蛋白提供了物质基础。 2 、克隆黄瓜CsWIP1 基因，并构建重组pGBKT7-CsWIP1 酵母双杂交诱饵质粒。 利用酵母转化试剂盒将诱饵质粒转入Y2H Gold 酵母感受态细胞中，经测定该诱饵质 粒对酵母生长无毒害作用且无自激活活性。构建重组pCsPI-AbAi 酵母单杂交诱饵质 粒，确定金担子素AbAr 的最低抑制浓度为150ng/mL，并检测了诱饵质粒的自激活和 毒性，结果显示该诱饵质粒自激活作用较弱，无毒性且 AbAr 的浓度在可控范围内， 可用于cDNA 文库的筛选。 3、CsWIP1 基因的酵母双杂交互作蛋白的筛选共得到29 个有效基因 （含重复）， 从中选取定位于细胞核且在花粉等花器官发育过程中表达的 2 个基因 （分别为 Csa7G024140.1 和 Csa2G116270.1）作为候选因子，其中 Csa7G024140.1 基因编码含 Bromodomain 结构域蛋白，其拟南芥同源基因AtBET10 是糖和ABA 信号的负向调节 因子，并在花粉萌发和花粉管伸长过程发挥作用；Csa2G116270.1 基因编码含HD 结 构域的蛋白，其拟南芥同源基因 AT2G23820 编码金属依赖性磷酸水解酶，在机体生 物代谢及生物调控中起作用。经蓝白斑回复鉴定可初步认为这两个基因与 pGBKT7- CsWIP1 存在蛋白质间的相互作用，并通过对候选基因进行功能预测来为后续的验证 提供方向。CsPI 基因的酵母单杂交互作成分筛选共得到 120 个互作因子，其中有 4 I 西北农林科技大学硕士学位论文 个乙烯相关转录因子，1 个MYB 家族转录因子及 1 个MADS-BOX 家族转录因子， 以转录因子为主要目的基因进行功能预测，为后续研究提供参考。 关键词：黄瓜、花发育、CsWIP1、CsPI、互作组分的筛选 II 目录 目 录 摘 要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 植物性型分化的研究进展 1 1.1.1 植物性型分化相关基因型的研究进展 1 1.1.2 植物性型分化相关激