过表达与干扰TRIB3基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的影响.pdfVIP

摘 要 摘 要 Tribbles pseudokinase 3 （TRIB3 ）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白，具有丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶的保守结构域，但是缺乏酶促反应所必需的关键氨基酸和ATP 结合区 域，TRIB3 无催化活性，可作为调节蛋白参与细胞增殖、分化、凋亡、糖脂代谢及肿 瘤发生等过程。TRIB3 不仅通过影响脂肪合成代谢的关键基因调控脂质代谢，还可由 外界刺激诱导而对细胞脂质代谢产生影响。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells, GMECs)为试验材料，克隆得到TRIB3 基因编码区；通过构建 干扰RNA 及过表达载体，转染奶山羊乳腺上皮细胞探究TRIB3 对乳腺上皮细胞脂质代 谢的作用；借助实时荧光定量PCR 和Western Blot 等方法检测细胞内脂质代谢相关基 因mRNA 、蛋白的表达量，细胞内甘油三酯含量和脂滴积累的变化；并从Akt 信号通 路研究 TRIB3 基因影响脂质代谢的机制，初步探究该基因在乳腺上皮细胞中调控乳脂 代谢的机制。获得如下主要研究结果： 1、TRIB3 基因克隆、序列分析及组织差异表达谱 根据 GenBank 中山羊的TRIB3 基因序列（XM_018057667.1 ），用 Primer Premier 5.0 软件设计克隆PCR 特异性引物，克隆得到奶山羊TRIB3 基因CDS 序列，其长度为 1074 bp，编码357 个氨基酸，蛋白分子量为39.60 ku，等电点7.8 ，亚细胞定位主要存 在细胞核内。同源性分析显示，西农萨能奶山羊与绵羊（Ovis aries ）、牛（Bos taurus ）、 小鼠（Mus musculus ）TRIB3 基因核苷酸及预测的氨基酸序列同源性分别为99%、96%、 71% ，与绵羊亲缘关系最近；TRIB3 基因在奶山羊乳腺组织中表达量最高，在肾脏组织 中表达量最低。 2 、过表达TRIB3 对乳腺上皮细胞脂质代谢的影响 成功构建 TRIB3 过表达质粒，获得重组真核表达质粒 pcDNA3.1-TRIB3 ，转染奶 山羊乳腺上皮细胞后，TRIB3 基因mRNA 表达水平上调40 倍左右，脂质代谢相关基因 GPAM、DGAT1 、PLIN1 、PPARg 的 mRNA 表达水平均显著下调（P0.05 ），过表达 TRIB3 显著降低细胞内总甘油三酯的含量，细胞内脂滴积累降低，细胞内脂肪酸组成 中C16:0 显著下调，C18:0 显著上调 （P0.05 ）。此外，（P0.05 ）p-Akt/PPARg 蛋白 水平显著下调，PPARg 启动子的活性显著下调（P0.05 ）。表明过表达TRIB3 基因能 够通过Akt 信号通路抑制乳腺上皮细胞的脂质代谢。 3、干扰TRIB3 对乳腺上皮细胞脂质代谢的影响 针对TRIB3 基因序列设计siRNA ，筛选得到siRNA-588 可有效降低TRIB3 表达的 60%，转染至奶山羊乳腺上皮细胞中，SCD1 、LPL 、DGAT1 、PLIN1 、LXRα 、PPARg 、 I 西北农林科技大学硕士学位论文 SREBP1 的mRNA 表达水平显著上调（P0.05 ），干扰TRIB3 显著上调细胞内甘油三 酯合成及脂滴积累，细胞脂肪酸组成中C16:0 显著上调，C18:0 显著下调 （P0.05 ）。 同时，显著上调p-Akt 、p-mTOR 、PPARg 蛋白水平的表达（P0.05 ），表明TRIB3 参 与到Akt 信号通路中，通过抑制Akt 的磷酸化作用影响脂质代谢过程。 通过干扰和过表达技术探究 TRIB3 在 GMECs 脂质代谢中的功能，为深入研究 GMECs 脂质代谢，完善乳脂代谢网络调控机制，提高羊乳品质奠定理论依据。 关键字：山羊；TRIB3 ；乳腺上皮细胞；过表达；干扰 II 主要符号对照表