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第六章 免疫金银及铁标记技术 免疫金技术发展简史 ? ? ? ? 1971 年 胶体金应用于免疫组化 1978 年免疫金技术检测 B 淋巴细胞表面抗原 1981 年免疫金银法 1986 年彩色免疫金银法 免疫胶体金银技术 一、免疫金技术 二、免疫金银法 三、彩色免疫金银法 四、免疫金和免疫金银法的优点 五、免疫金银法染色中常见的问题及对策 六、免疫胶体铁技术 一、免疫金技术 胶体金： 金的水溶液，具有一般溶胶特性。 胶体金制备： 化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂 使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒， 形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。 胶体金颜色： 用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是 不同颜色的胶体金颗粒。 5-20nm 葡萄酒红 20-40nm 深红色 60nm 橙黄色 还原剂： 白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等 胶体金标记： 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被 过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡 萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清 白蛋白多肽缀合物等非共价结合。 1 制备胶体金的准备 （ 1 ）玻璃器皿的清洁 流水冲洗；清洁液浸泡 24h ；自来水洗净清洁液；洗洁剂洗 3 ～ 4 次；自来 水冲洗；蒸馏水洗 3 ～ 4 次；双蒸水把每个器皿洗 3 ～ 4 次；烤箱干燥后备用。 不需硅化处理可直接制备胶体金。 为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液 包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净 。 (2) 试剂 容器 : 酸处理洗净 配制试剂 : 双蒸馏水或三蒸馏水 氯化金水溶液的配制： 1g 的氯化金溶解于双蒸水中配成 l ％的水溶液；4℃冰箱 内保存。 白磷配制： 在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存 2 胶体金的制备 白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、柠檬酸钠 — 鞣酸还原 法、乙醇超声波还原法、硼氢化钠还原法、放射性胶体金制备法 常用的方法 :2 种 (1) 柠檬酸三钠还原法 制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。 制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。 操作步骤： 1 ） 1ml l ％氯化金加入 100ml 蒸馏水中，煮沸。 2 ）迅速加入 4mll ％柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。 3 ）自来水冲洗烧瓶，冷却。 (2) 柠檬酸钠 — 鞣酸还原法 特点： 通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金， 且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。 原理： 柠檬酸三钠 —— 主要为还原剂。 鞣酸 —— 还原、保护作用，决定胶体金颗粒大小形成 。 操作步骤： 1 ）根据所需的胶体金颗粒分别配制 A 液和 B 液。 2 ）将配制好的 A 、 B 两液在水浴内加热到60℃，保持温度稳定。 3 ）在电磁搅拌器上搅拌 A 液迅速加入 B 液，加热 7 ～ 10min 至胶体 金变成葡萄酒色。 4) 用自来水冲洗烧瓶，使之迅速冷却。 制备胶体金时都应注意以下各点： ① 所有溶液均应用双蒸水配制 ② 柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配 ③ 用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理 ④ 在清洁干燥的烧瓶中加入少许 1 ％硅油，轻轻转动烧瓶， 使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。 烧瓶置烤箱内烘干。 上述步骤可重复 2 ～ 3 次 3 蛋白质的胶体金标记 ? 原理： PH 值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈 中性 ，此 时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白 质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固 吸附 于金颗 粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体 金处于 稳定 状态； PH 值高于蛋白质等电点时，蛋白质带 负电荷 ，与胶体金颗粒 负电荷相互 排斥 不能结合。 稳定剂： 牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶 （ 1 ）待标记蛋白质准备 透析除盐 除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会