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学习细菌培养的基本技术 实验目的 了解配制培养基的一般步骤和方法。 练习配制牛肉膏蛋白丿冻培养基。 了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法。 初步学会细菌培养的基本技术。 实验原理 根据细菌的需要配制培养垒，在培养之前要彻底灭菌。根据某种细菌的营养需要而选择 多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种背养物质，还要 有适宜的pH、离子浓度。本实验所用的牛肉膏蛋白豚培养基，应用较广泛,适于芽砲 杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养，配制好的培养基必须经过灭菌。灭菌是指杀 死液体或固体表面所有微生物的细胞、芽總和抱了。对不同的材料，应当采取不同的灭 菌方法。培养基一般采用高圧蒸气灭菌法,就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸气 灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸气。当水蒸气将锅内的冷空气排尽以后, 关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而 达到灭菌的冃的。接种环是用火焰烧灼灭菌的。无菌室或超净工作台则是通过紫外线照 射灭菌的。 将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好 的细菌群体，它们在培养基上会呈现出一定的形态特征。 实验材料 天平、角匙、200 mL烧杯、试管、漏斗、最筒、玻棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、 酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种坏、pH试 纸、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作箱。芽电杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉育、 蛋口J冻、琼脂、NaCl、浓度为I mol/L的NaOH溶液、体积分数为75%的酒稱溶液、 蒸锦水。 实验方法与步骤 （1） 培养基的配制 细菌培养的基础是配制培养基牛肉青蛋白丿冻培养基的配方然后再加热溶解，补足水分， 其制作过程包括以下几个环节： 清洁玻璃器皿一般用肥皂液煮沸30 min,或用重锯酸钾和浓硫酸配制的溶液浸泡数 10 min,然后用清水冲洗，晾干后保存备用。 配制液体培养基a.根据需要配制培养基数量，先在烧杯屮注入少MBffl水；b.按 培养基配方称最各种成分的原料，依次使之溶解：c.补足需水最；d.如用牛肉膏、蛋 白豚配制时，需加热熔化后溶解：e.加热后，补足水分即可。 配制固体培养基在液体培养基里加入一定量的琼脂，加热熔化即可。 调pH先用栉密pH试纸测杲培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培养基滴加1 mol/L的NaOH溶液，边加边搅拌，并随时用pH试纸测pH,直到7.4?7.6为止。反之 则用1 mol/L的HC1进行调节。 过滤分装 用纱布趁热过滤，将滤液分装于试管屮，其量约为试管体积的1/5 （不要 玷污管壁）° 加棉塞 培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染：保证通 气良好，加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。 包扎每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后用线绳 扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。 （2） 灭菌 高圧蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。具体操作如下： 打开高压灭菌锅，取出里面的灭菌桶，向锅内加水（最好用开水）水面与底架平齐为 宜。 将扎好的试管管口向上，竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放冋灭菌锅。 注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。 加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两 个紧固螺栓，以防漏气。 排出锅内的冷空气。打开火源，当压力上升到49 kPa时，打开排气阀放气，当圧力 冋到0时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。 当锅内的压力上升到98 kPa时,控制火力大小,使压力维持在98 kPa左右20 min, 切断电源。 当压力降至0以后,打开排气阀，完全排出水蒸气(约10 min)后,放松紧固螺栓, 取出试管。最后，将灭菌锅里的水排放干净。 搁置斜面 灭菌后的培养基冷却到50°C时，将每个试管带棉塞的一端搁在一根木棒上，使培养基 形成斜面，斜面的长度不超过试管总长度的一半。 接种 用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精棉球(体积分数75%)擦拭双手。 当手上酒精挥发后，点燃洒精灯。 接种，操作程序见下图。 a b c d e .用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，并使 斜面向上成水平状态。右手拧松棉塞，但不要取下。 右手拿接种环（如握钢笔），在火焰上烧灼灭菌。注意：有可能仲入试管内的接种环 其余部分也要烧灼，特别是篩处。 在火焰边用右手无名指和小指夹住两个郴塞，将它们取下（不能放下）同时左腕转 动烧灼管口一周，勿烧得过烫。 将接种环伸入菌种试管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。轻轻挑 取少量菌体，立即将接种环抽出。 在火焰旁迅速将沾