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（４）冷冻保护剂 是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。 冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类 ： 渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内， 一般是一些小分子的物质。 主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、 甲醇等。 非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内， 一般是些大分子物质。 主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、 聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及 羟乙基淀粉等。 １、培养物的冷冻保存与复苏原理 体外培养的基本原理与技术及检测方法 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。 传代培养的实质就是分割后再次培养。 只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个器皿之内继续培养就算传代。即便是按“一传一”的比例进行传代。 体外培养的基本原理与技术及检测方法 1、原代培养物需要传代的指标 2、传代的过程 3、传代培养的注意事项 二、体外培养的基本方法和过程 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 （1）植块培养物与器官培养物： 植块培养物生长一定时间之后，从植块内长出（outgrowing）的细胞会越来越多，迁移出来的细胞也会不断分裂繁殖，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间逐渐发生接触性抑制现象。 若不将原代培养物分割再进行培养，植块培养物可能会停止生长。 1、原代培养物需要传代的指标 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 （2）分离（散）细胞培养物： 对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时便需要进行传代。 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。 1、原代培养物需要传代的指标 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 （3）悬浮培养物： 悬浮培养细胞之间虽然不容易发生接触性抑制现象，但随着培养液中细胞数量的增加，细胞的生存空间会越来越小，营养供应愈趋紧张，代谢产物积聚，培养环境逐渐不适应细胞的生长，因而需要传代。 1、原代培养物需要传代的指标 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 1、原代培养物需要传代的指标 2、传代的过程 3、传代培养的注意事项 二、体外培养的基本方法和过程 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （1）分离（散）细胞培养物 ： （贴壁依赖型细胞） 1）弃去原培养液（吸出或倾倒） ； 2）漂洗：1~2次， 3）离解细胞： 4）终止消化： 5）吹打分离细胞： 6）离心： 7）重新悬浮、计数： 8）分装： 9）送培养箱继续培养。 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 （2）悬浮培养物：无需分割培养物。 1）离心： 2）重新悬浮、计数： 3）分装： 4）送培养箱继续培养。 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （3）植块培养物： 对这种培养物，仅在少数情况下再培养。 由于它们一般是种植在生长基质盖玻片上，再培养时一般不更换生长基质盖玻片，只是将培养物分割并舍弃部分培养物，而将剩余的培养物继续培养 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 1、原代培养物需要传代的指标 2、传代的过程 3、传代培养的注意事项 二、体外培养的基本方法和过程 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和过程 3、传代培养的注意事项 传代培养首先必须注意的事项： 根据不同细胞的承受能力； 选择合适的时间； 采用适当的方法。 （二）继代培养（secondary culture） 体外培养的基本原理与技术及检测方法 二、体外培养的基本方法和