慢病毒载体包装构建过程[汇编].docxVIP

精品资源·有用参阅品 文档收拾 | 学习参阅 Summary compilation 慢病毒载体包装构建进程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，然后到达持久性表达意图序列的效果。在感染才能方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，然后到达杰出的的基因治疗效果。关于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分解的细胞等，运用慢病毒载体，能大大提高意图基因或意图shRNA的转导功率，且意图基因或意图shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大添加，可以比较方便快捷地完成意图基因或意图shRNA的长时间、安稳表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺点病毒-1 (H IV-1) 来历的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、安稳整合所需求的遗传信息，是慢病毒载体体系的首要组成部分。带着有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅佐下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，经过感染细胞或活体安排，完成外源基因在细胞或活体安排中表达。 辅佐成分：慢病毒载体辅佐成分包含： 慢病毒包装质粒和可发生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、安稳整合所需求的遗传信息。慢病毒包装质粒可供给一切的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需求的一切辅佐蛋白。为发生高滴度的病毒颗粒，需求使用表达载体和包装质粒一起共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒排泄到细胞外的培育基中，离心获得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，意图基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，然后高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体体系由两部分组成，即包装成分和载体成分。 包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式效果序列而构建，可以反式供给发生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分隔构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其意图也是下降康复成野生型病毒的或许。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收成只要一次性感染才能而无仿制才能的、带着意图基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式效果序列，一起具有异源启动子操控下的多克隆位点及在此位点刺进的意图基因。 为下降两种成分同源重组康复成野生型病毒的或许，需尽量削减二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)当即前期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、 试验流程（1和2为并排过程） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 规划上下游特异性扩增引物，一起引进酶切位点，PCR(选用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或许文库）调取意图基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒搅扰质粒载体的构建 组成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒搅扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒络绎质粒及其辅佐包装原件载体质粒，三种质粒载体别离进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为彻底培育基，培育24和48h后，别离搜集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液经过超离心浓缩病毒。 二、试验资料 2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装体系为三质粒体系，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其间质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。 载体信息 慢病毒克隆载体图谱如下： 2） 包装质粒信息如下： PMD2G载体图谱和序列信息 PSPAX2载体图谱和序列信息： 细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依靠型成上皮样细胞，成长培育基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培育成长增殖构成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅佐包装载体质粒。 三、流程图