副溶血性弧菌检验操作程序.docx

副溶血性弧菌检验操作程序 范围 本程序规定了粪便标本中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图4。 36 ℃ 36 ℃±1 ℃，12 h～16 h 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 粪便或肛拭子 挑取3个或以上可疑菌落，接种于3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 进行系统生化鉴定 结果与报告 血清学分型、PCR毒力基因鉴定 氧化酶试验，3％氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验 3％氯化钠碱性蛋白胨水 TCBS或科玛嘉弧菌显色培养基 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 副溶血性弧菌检验程序 操作步骤 标本收集 标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。 所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在室温条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，室温条件下8 h内送检。 分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，将拭子放入3%氯化钠碱性蛋白胨水。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。 肛拭子：操作程序同新鲜粪便。 转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；将拭子放入3%氯化钠碱性蛋白胨水。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。 碱性蛋白胨水于36 ℃?1 ℃培养12 h～16 h，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离，36 ℃?1 ℃培养18 h～24 h。 菌落特征 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2 mm～3 mm。 纯培养 挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 初步鉴定 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 ℃±1 ℃培养24 h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。 确定鉴定 刮取3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定试剂盒鉴定。 血清学分型 4.1 制备：接种两管3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。用含3%氯化钠的5%甘油溶液冲洗3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。 4.2 K抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测。用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。在对照间隔内加一滴3%氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。 4.3 O抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121 ℃高压1 h。高压后4 000 r/min离心15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4 000 r/min离心15 min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。如果未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121 ℃再次高压1 h后，重新检测。如果仍旧为阴性，则培养物的O抗原属于未知。根据表8报告血清学分型结果。 副溶血性弧菌的抗原 O群 K型 1 1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，69 2 3，28 3 4，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，75 4 4，8，9，10，11，12，13，34，42，49，