基因工程常规技术应用-相互作用研究技术应用.pptVIP

相互作用研究技术;;染色质免疫沉淀技术（ChIP）;甲醛处理使蛋白质与DNA交联;ChIP技术的发展;; 凝胶阻滞试验(EMSA);原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生 了相互作用。;方法：;EMSA可以通过加入超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA)鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子 (比如特异的转录因子等)，以及发生此种结合作用的DNA序列的特异性。 如果竞争DNA与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，不会出现阻滞的条带。;在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 (a)没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带； (b)加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失； (c)竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同(a)一样的阻滞条带。; DNaseI足迹试验;;主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。; 酵母单杂交;转录激活结构域 （activation domain，AD）;操作流程;应用领域： 主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用； 用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因； 验证??式转录调控因子的DNA结合结构域； 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。;Yeast Two Hybrid System (Interaction trap);作用：有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质;;2. 拆开 Domain;3. 重组Domain;上游激活序列（UAS）;上游激活序列（UAS）;双杂交原理;GST pull-down