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猪抗蓝耳病、圆环病毒病相关基因的鉴定与功能分析 猪病已成为当前制约养猪业健康发展的关键因素之一 , 其中猪蓝耳病和圆环 病毒病为危害世界养猪生产的两大重要的疫病。 PRRSV和 PCV2都是能导致猪繁 殖障碍的主要病原 , 此外 , 造成猪的免疫抑制 , 引起其他病原微生物的继发或并发 感染 , 给世界的养猪业造成了巨大的经济损失。 猪的遗传学组成能够影响宿主对病毒的易感。研究表明 , 不同的猪种间对 PRRSV和 PCV2相关疾病的易感性存在差异是由于宿主遗传差异导致的。 本研究首先对与 PRRSV抗性相关的两个候选基因 USP18和 Mx1进行了启动子 区功能分析 , 然后在实验条件下 , 研究遗传背景不同的莱芜猪和大长杂交商品猪 对 PCV2易感是否存在差异以及探讨抗性或易感差异的分子机制 , 寻找与猪抗 PPRSV和 PCV2有关的分子标记。 主要的研究结果如下 :1. 本研究对比了中国地方 猪种大蒲莲猪和杜 - 大 - 长杂交商品猪 USP18基因启动子区活性 , 以及筛选了单核 苷酸多态性对 USP18转录的影响。 我们发现大蒲莲猪的启动子活性明显高于杜 - 大- 长杂交商品猪 (Plt;0.05); 启动子删除试验中 , 当启动子从 -1790 删除到 -1314 时, 其转录活性下降约 60%(Plt;0.05); 同时 MARC-145细胞感染 PRRSV前后 , 在此区段的单核苷酸多态 位点 G–1533A 均能提高 USP18基因 mRNA的表达。群体遗传学分析结果显示等位 基因 A 只存在于对 PRRSV抗性更强的中国猪种中。 这些结果表明猪 USP18基因启动子区的单核苷酸多态位点 G–1533A 多态性 是抗 PRRSV的一个潜在的 DNA分子标记。2. 猪 Mx1基因启动子区的 -2713 到-2565 和 -688 到-431 两个区域存在顺式作用元件。 通过对扩增的猪 Mx1基因启动子区进行测序和比对 , 发现在 -547 位点发现了 一个 275bp 的短散布重复元件 (SINE) 。等位基因 B(有 275bp 的插入 ) 主要存在于 中国地方猪种中 , 而在西方瘦肉品种中频率很低。 分别将含有和不含 275bp 片段插入的启动子通过瞬时转染 MARC-145细胞 , 比较其荧光素酶活性。结果显示不论是在感染猪繁殖与呼吸综合征 (PRRSV)前还 是感染后 ,275bp 片段的插入均显著提高了荧光素酶的活性 (Plt;0.05) 。 这些结果表明 Mx1基因启动子区 -547 位点的 SINE插入多态性是一个潜在的 PRRSV的 DNA分子标记。3. 随机采样 6 周龄的 15 头莱芜猪和 15 头大长杂交商品猪。 所有的猪只 PCV1,PCV2,PRRSV和 PPV抗原抗体检测为阴性。随机分成四组 , 莱芜猪和大长杂交商品猪攻毒组各 10 头, 对照组各 5 头。 攻毒组肌肉注射 3ml(103.8tcid50/ml) 的 pcv2-sd 毒株 , 对照组接种等量的 磷酸盐缓冲液。攻毒当天被记为 0d。 攻毒后每天测量体温 , 观察临床症状 , 分别在 0d、4d、 7d、10d、 14d、21d、 28d、35d 称重、采集血液 , 利用 pcr 及绝对定量 pcr 对血清中的 pcv2dna 病毒拷 贝数及细胞因子的变化 (il-1 β、il-2 、il-4 、il-6 、il-8 、il-10 、il-12 、gm-csf 、 ifn- γ、tgf- β1 和 tnf α) 进行分析 ,elisa 试剂盒检测 igg 的变化。35d 剖杀时 采集肺脏、扁桃体、胸腺、回肠、脾脏、肝脏和淋巴结等组织 ,10%福尔马林溶液 固定 , 制作组织切片 ,he 染色观察病理变化。 结果表明 : 从攻毒的 0d 到 35d, 攻毒组莱芜猪与攻毒组商品猪相比 ,60%(6/10) 的商品猪出现了猪断奶后多系统衰竭综合征的典型临床症状 , 例如食欲下降 , 咳 嗽 , 拉稀和渐进性消瘦 , 偶尔打喷嚏 ; 攻毒 14d 后, 商品猪最显著的症状是皮肤上 出现圆形或形状不规则的红紫斑和丘疹 , 主要是在背部和后退部位。大约一半的 商品猪攻毒后 14d 到 28d 间出现了呼吸急促。 莱芜猪未出现明显的临床症状 , 只出现轻微的厌食 , 咳嗽和发热等症状。与对 照组相比 , 商品猪从攻毒后的第 10d 开始直肠温度高于 40℃一直持续到 14d。 莱芜猪体温变化不显著。与对照组比 , 在整个攻毒期间莱芜猪的体重无显著 变化 , 而商品猪在攻毒后 21d 到 35d 之间平均体重明显低于对照组。 大长杂交商品猪的肺脏出现不同程度的肺充血 , 严重病例肺泡出血 ,