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线虫的培养及其发育过程的观察 一、 实验原理 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegan)属于线虫动物门(Nematoda)隐 杆线虫属(Caenorhabditis)秀丽隐杆线虫 种(C.elegans),根据命名法则中的二名法 命名为 Caenorhabditis elegans。上世纪六 七十年代分子遗传学的奠基人之一 Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物 学的研究的模式生物。C.elegans为蠕虫状, 长度约1mm,因其个体结构简单、体细胞 数目恒定，特定细胞位置固定，生活史短、 遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在 遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰 老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物 机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反 应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛 应用o如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干 扰技术最早都是在线虫中被揭示的。 HYPERLINK // （一）C.elegans的基本结构以及生活史 C. eleg arts有雌雄同体（XX）和雄虫（XO） 两种性别，在自然条件下，成虫大多为雌 雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。 其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶 原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵 管、储精囊，及单一一个子宫（图1, 2）, 雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为 交配用的尾部（图3, 4）o C.elegans是唯 个身体中的所有细 胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫 含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，而 它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞 数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共 产生1090个细胞，其中131个在特定时期 凋亡，因此，其成熟后含有959个体细胞和 2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只 有1031个体细胞和1000个生殖细胞。 C. elegans有五对常染色体和一对性 染色体，是一个染色体数很少的二倍体。 雌雄同体图1雌雄同体线虫解剖示意图图2雌雄同体线虫 雌雄同体 图1雌雄同体线虫解剖示意图 DIC （微分干涉显微镜）拍摄的图; 雌雄同体线虫解剖示意图 图3雄虫 雄虫解剖示 意图； DIC （微分干 涉显微镜）拍摄的图; 性腺放大图； 尾巴放大图； L3时期雄虫尾巴图（上面是雄虫尾巴，下 面是雌雄同体的尾巴） ?WormAtias SEM 图4：电镜下的雄虫 C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫 期（L1-L4）.成虫期三个阶段（如图6）o 一 个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵 经过UL、L2、L3、L4 4个幼虫时期，进入成 虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、 缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时 期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。 C.elegans在实验室20-22°C的条件下，约 3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可 以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受 精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精 （图 5）o 图5雄虫和雌雄同体线虫交配 根据实验需要，可将线虫饲养在固 体培养基或者液体培养基中。 Adu 一二二」9二 SO 匸3 (capab-eaeggttysg)Young aduH(900,940T:m) :iu= moK s ofwo developmentusomaFirst dea§7:0 3215fo_dL4 (629650 匸 Adu 一二二」9二 SO 匸3 (capab-eaeggttysg) Young aduH(900,940T:m) :iu= moK s ofwo developmentusomaFirst dea§7:0 32 15fo_d L4 (629650 匸3 yfod Dauer *o_d L3 (490.5」 Predauer {L2S L2 3693801 eggs taxi ai Gasiru-a _approx_m??y $celn crowd-ng starva-9□(250 ym〉h?gh _on_p dOM 12 hr 图6 22°C下秀丽隐杆线虫的生命周期 二、 实验目的 1、 理解线虫作为模式生物的优势以及在 相关研究领域的应用； 2、 掌握线虫的基本培养技术，观察并且区 分两种线虫个体发育过程的异同； 三、 实验器材 实验器材 恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、 6cm培养皿、挑针、摇床、10ml离心管以及 管架、1.5ml离心管以及管架、250ml锥形 瓶、酒精灯、75%酒精棉球 实验试剂 野生型N2线虫、E. coli OP50、LB固体培养 基、LB液体培养基、NGM培养基等。 四、 实验步骤 2、线虫培养板的准备： (1)配置 NGM(Nematode Growth Me