DNA聚合酶β（Polβ）互作蛋白在碱基切除修复中的作用机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 人体的基因组始终暴露在内源及外源的各种DNA 损伤因子下，而这些DNA 损伤因子很有可能导致DNA 损伤。DNA 损伤如果不被有效修复，将会影响DNA 复制、转录及染色体结构，甚至导致机体产生多种疾病，如癌症。为了修复DNA 损伤，人体进化出了DNA 损伤修复系统以应对各种DNA 损伤试剂的威胁。碱 基切除修复作为人体最为重要的DNA 损伤修复系统之一，在修复烷基化、氧化、 AP 位点及单链断裂的 DNA 损伤中发挥重要作用。为了确保碱基切除修复能够 及时、准确、高效地修复DNA 损伤，机体内部存在多种对其调控的机制，包括 蛋白质-蛋白质相互作用及翻译后修饰等。在本研究中，我们重点关注碱基切除 修复的核心蛋白——聚合酶Pol β (DNA Polymerase beta ，Pol β)，寻找与Pol β 结合的蛋白质并研究它对Pol β 及其参与的碱基切除修复过程的影响。为此，我 们通过质谱及免疫共沉淀等技术鉴定出新的 Pol β 互作蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢 酶 （GAPDH ）和组蛋白去乙酰化酶3 （HDAC3 ），并集中研究了它们在碱基切 除修复中的作用机制。其研究结果如下： 1. GAPDH 结合Pol β 并参与碱基切除修复 （1）一系列的免疫共沉淀实验证明了GAPDH 和 Pol β 存在直接的结合， 并且DNA 损伤刺激能够增强细胞内的两者的相互作用。 （2 ）研究了GAPDH 和Pol β 结合对两者稳定性及活性的影响。结果显示， 蛋白间的相互作用不影响两者的稳定性。在活性方面，GAPDH 可促进Pol β 的 聚合酶活性，而Pol β 对GAPDH 糖酵解活性没有影响。 （3 ）由于Pol β 活性和碱基切除修复效率密切相关，因此，我们进一步研究 GAPDH 对碱基切除修复效率的影响。我们分别使用纯化的重组蛋白和细胞裂解 液重构碱基切除修复过程。结果显示，GAPDH 可以显著促进碱基切除修复效率。 （4 ）我们研究DNA 损伤情况下，GAPDH 核转运参与DNA 碱基切除修复 的具体机制。结果显示，DNA 损伤处理促进酪氨酸激酶 Src 信号的激活，激活 的Src 介导了GAPDH 的磷酸化并促进其入核。采用小干扰RNA 敲降细胞中的 GAPDH 表达或者用 Src 抑制剂抑制GAPDH 的核转运，细胞对DNA 损伤试剂 更为敏感。 （5 ）靶向 DNA 损伤修复通路常用作肿瘤治疗的一种手段，对于抑制碱基 切除修复通路相关蛋白来治疗肿瘤也被广泛研究。基于GAPDH 在碱基切除修复 中的发挥重要功能，我们初步探索了敲低肿瘤中GAPDH 的表达水平在肿瘤化疗 中的作用。异种移植小鼠皮下结肠癌肿瘤模型显示，特异性地抑制肿瘤中GAPDH I 摘要 的表达会增加肿瘤对化疗药物5-FU 的敏感性，这一结果提示GAPDH 有可能成 为联合肿瘤化疗的一个新的靶点。 2. HDAC3 结合Pol β 并参与碱基切除修复 （1）HDAC3 在细胞内可以和Pol β 直接结合。通过构建不同区段的截断体 并结合免疫共沉淀实验，我们发现 HDAC3 其N 端1-180 位的氨基酸是和Pol β 结合必需区段。 （2 ）DNA 损伤刺激能增强细胞内HDAC3 和Pol β 的相互作用。 （3 ）HDAC3 可增强Pol β 的聚合酶活力，并对碱基切除修复效率起促进作 用。 （4 ）抑制HDAC3 在细胞内表达降低了胞内碱基切除修复效率，使得胞内 DNA 损伤大量积累，导致细胞对DNA 损伤试剂的敏感性增加。 综合以上，我们以碱基切除修复的重要蛋白Pol β为中心，鉴定出新的Pol β 互作蛋白GAPDH和HDAC3 ，并论证了它们对Pol β功能及对碱基切除修复过程影 响。我们的研究进一步丰富了Pol β 的结合蛋白，拓展了甘油醛-3-磷酸脱氢酶和 组蛋白去乙酰化酶