番茄抗叶霉病相关基因片段克隆及vigs重组载体的构建与鉴定.docx

番茄抗叶霉病相关基因片段克隆及 VIGS 重组载体的 构建与鉴定 病毒诱导的基因沉默( virus induced gene silencing ， VIGS)是指携带目标基因片段的重组载体在通过各种方法侵染植 株后， 可诱导植物内源基因下调表达或者不表达的现象。 目前该 技术广泛用于番茄、烟草、小麦、水稻，在大麦、马铃薯等作物 上的应用也有报道。研究表明，利用 VIGS技术已经使得一些基 因在番茄中被成功沉默，如 NPR1、TGA1a、NbCA1、NTF6、MEK1、 MEK2等多个抗病相关基因。VIGS具有技术简单、研究周期短、 侵染效率高、 不需要遗传转化等优势， 这种反向遗传学新技术已 成为一种低成本、高通量地鉴定植物中各种基因功能的新技术， 在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用。 1995年，Kumagai等利用人工构建的植物内源基因片段在本 氏烟中首次将PDS基因进行沉默。八氢番茄红素脱氢酶(PDS 是影响类胡萝卜素合成的限速酶之一， 常将该基因作为评价 VIGS 是否成功的参照基因。 在番茄、 柑橘等花或果实以类胡萝卜素为 主要色素的植物中，随着类胡萝卜素含量增加， PDS基因表达量 呈上调趋势。 若该基因被成功沉默， 植株将会表现幼嫩叶片漂白 的症状，表型变化易于观察辨别。 细胞色素P450 (cytochrome P450，CYP广泛存在于动物、 植物、细菌、真菌等细胞内，在植物体内参与植物激素等化合物 的生物合成、代谢解毒以及抗病等重要生理活动。 Frear 等于 1969年首先在棉花中发现细胞色素 P450,随后在小麦、水稻和 拟南芥等作物中也陆续分离出细胞色素 P450O细胞色素P450的 研究主要集中于其在生物体内发挥的功能， 它不仅参与植物体内 的基础代谢， 更重要的是参与植物的次生代谢， 在代谢过程中可 以产生很多重要的、 可以抵抗病虫害以及环境胁迫的次生代谢产 物。 本研究分别构建 CYP90A1-like、PDS基因的VIGS载体并对 载体进行鉴定， 以证明其可靠性， 为下一步分析基因沉默后的植 株感病情况提供试验材料， 以便进一步探讨该基因与番茄抗叶霉 病之间的关系。 1 材料与方法 材料 以番茄含有Cf-19基因的抗病品种CGN1842功试验材料， 叶霉菌生理小种为1.2.3.4.（笔者所在实验室提供）。番茄试 验材料在东北农业大学园艺实验站温室内常规种植。 在苗期，生 长至四叶一心时取新鲜叶片用于基因片段克隆。 分别采集感染叶 霉菌 0、 3、 5、 7、 9、 15、 20 d 后的阳性植株与对照组植株叶片， 用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR。以上材料采集后均立即用 液氮冷冻，并在-80C保存备用。 试验方法 1.2.1番茄叶片总RNA提取及cDNA第 1链合成按照笔者所 在实验室改良的Trizol法进行总RNA提取，用超微量分光光度 计和琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA质量。利用cDNA第1链合成试 剂盒（北京全式金生物技术 XX公司）进行反转录。 122 CYP 90A1-like 、PDS基因片段的克隆、测序根据 GenBank中公布的番茄 CYP 90A1-like基因片段序列（登录号： JZ717738）,设计特异引物，引物序列见表1。20卩L CYP90A1 -like 基因片段的PCR扩增体系为：各2卩L cDNA和上、下游引物，10卩L 6X Taq MasterMix、4 卩 LddH2Q 扩增程序：94C预变性 5 min ; 94C变性40 s, 58C退火40 s, 72C延伸1 min,共35个循环； 72C延伸 10 min。 电泳检测并进行胶回收后，基因片段分别与pMD18-T载体连 接，转化大肠杆菌。阳性菌落提取质粒后进行酶切验证、测序。 1.2.3实时荧光定量（qRT-PCR检测CYP 90A1-Iike 基因 与抗叶霉病的相关性分别采集幼嫩叶片，提取感染叶霉菌 0、 3、 5、7、9、15、20 d的阳性植株与对照组植株的 RNA以番茄肌 动蛋白基因 Actin 为内参基因， 每个样品重复 3 次，进行实时荧 光定量PCR检测感病后CYP90A1-like基因的相对表达量。 1.2.4 载体的构建及鉴定 CYP 90A1-like 基因采用限制性内 切酶EcoR I、Bam HI双酶切，连接到同样用 EcoR I、BamHI 双酶切的pTRV2载体中，将双酶切之后的产物进行胶回收处理， 转化大肠杆菌。 将菌液提取质粒PCF进行双酶切鉴定，筛选阳性克隆提取质 粒进行测序验证，阳性克隆送北京六合华大基因科技 XX公司测 序，获得正确序列的载体质粒即为重组载体 pTRV2-CYP90A1-like 、 pTRV2-PDS。 2 结果与分析 2.1番茄叶