番茄早疫病拮抗放线菌10―4菌株的发酵条件.docx

番茄早疫病拮抗放线菌10^4菌株的发酵条件 早疫病是番茄生产上重要的病害之一，由茄链格孢属真菌 ( Alternaria solani )引起，该菌寄主范围广泛，除番茄外， 还可感染辣椒、茄子、曼陀罗和马铃薯等 [1] 。该病常年造成番 茄减产20%- 30%严重时可达50%以上，甚至绝产[2]。目前生 产上并无高抗或免疫的品种， 因此运用抗病种质防治该病并不现 实[3] ，而化学农药的长期过量使用， 又会导致病原菌抗性增强， 对环境污染加重，以及番茄果实有农药残留等现象，因而，探寻 新的防治番茄早疫病的方法和药剂是目前生产上亟待解决的问 题。利用微生物来防治植物真菌病害是当今植物真菌病害界十分 热门的研究领域之一。微生物防治是指通过生物间的相互作用， 利用有益微生物或其代谢产物抑制致病微生物生长的生物防治 手段 [4] 。微生物资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本 低、兼防兼治、增产增收、保持生态平衡、起到长效的作用，所 以具有广阔的发展前景 [5] 。放线菌是最早被研究且应用到生产 中的能产生大量抗生素的一种生防微生物， 已有利用放线菌防治 番茄早疫病害的报道 [6] 。菌株 10-4 是笔者所在课题组从西藏色 季拉山亚高山草甸土壤中分离筛选出的 1 株对番茄早疫病菌有 较强抑制作用的菌株，初步鉴定为腐生链霉菌 [7] 。为提高其产 素水平， 为工业发酵生产提供依据， 本研究采用生长速率法对不 同培养基和发酵条件下 10-4 菌株发酵液的抑菌活性进行测定， 旨在筛选适宜的培养基和优化其适宜的发酵条件， 以期为农用活 性物质的开发和分离提供依据。 1 材料与方法 试验材料 试验菌菌株 10-4 ，分离自西藏色季拉山亚高山草甸土 壤中。 指示菌番茄早疫病菌，由西藏大学农牧学院真菌实验 室提供。 1.1.3 培养基配方种子培养液： 3 g 蛋白胨， 2.5 g 葡萄糖， 2 g CaC03, 1 000 mL 1%大豆饼粉浸汁，pH值为7.2。发酵培养 液：选用 12 种发酵培养基（表 1 ）[8-9] ，各培养基 pH 值均为 7.2，所有培养基均在 121 C、0.1 MPa条件下灭菌30 min后 备用。 试验方法 1.2.1 初始发酵培养液基筛选将菌株 10-4 活化，用打孔器 打成直径为5 mm的菌块，在250 mL三角瓶中接入50 mL种子培 养液，再将菌块放入三角瓶中，于 28 C、160 r/mi n培养4 d, 获得种子液。在 250 mL 三角瓶中分别装入 50 mL 12 种发酵培 养基，按1%的体积分数接入种子液，28 C、160 r/min 振荡 培养 4 d 后，培养滤液 10 000 r/min 离心 25 min ，上清液用 直径为0.45卩m的无菌过滤膜过滤，将滤液与 PDA培养基按 体积比1 : [KG-*3]9制成平板，接入直径为5 mm预先活化的 指示菌块，以不加发酵液的 PDA 为对照培养基，设 3 次重复。 28 C下培养4 d，测量菌落直径，计算抑菌率，评价代谢物的 活性。 根据菌丝生长抑制率确定最佳发酵培养液。 菌丝生长抑制 率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径x 100% 122培养温度对发酵液抑菌活性的影响在 250 mL三角瓶 中先接入 50 mL“1.2.1 ”节中筛选出的发酵培养液，再接入 1 % 种子液，设24、26、28、30、32、34 C等6个温度水平，160 r/min 振荡培养 4 d 。按“1.2.1 ”节中的方法确定最佳的培养温度。 1.2.3 种子液种龄对发酵液抑菌活性的影响将“ 1.2.1 ”节 中筛选出的培养基以 1%的量分别接入种龄为 24、 28、 32、 36、 40、44、48、52、56、60 h 的种子液，28 C、160 r/min 振荡 培养 3 d ，按“1.2.1 ”节中的方法确定最佳的接种菌龄。 1.2.4初始pH值对发酵液抑菌活性的影响将“ 1.2.1 ”节中 筛选出的培养基用 HCI、NaOH分别调节pH值为3、4、5、6、7、 9、10、11、12,高压灭菌，接入 1 %种子液，在28 C、160 r/min 条件下培养 3 d ，用生长速率法测定发酵液的抑菌作用。 1.2.5接种量对发酵液抑菌活性的影响将 50 mL发酵液装于 250 mL的三角瓶中，将培养 36 h的种子液以1% 3% 5% 7% 10% 15% 20%的量（体积分数）分别接入发酵瓶中，培养 3 d 并进行效价的生物测定。 1.2.6发酵？I件的正交试验在以上试验结果的基础上， 选取 发酵温度 装液量 发酵时间为主要发酵条件，设计 3 因素 3 水 平的正交试验，结果如表 2 所示。按不同的发酵条件发酵培养后， 测定发酵液抑菌率的大小