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白僵菌菌株的 ITS 序列鉴定 白僵菌属 Beauveria Vuill. 是全球分布的最常见的土壤虫 生真菌 [1] ，包含有球孢白僵菌 B. bassiana （ Bals.-Criv. ） Vuill. 和布氏白僵菌 B. brongniartii （Sacc. ） Petch 这两 种具有重要经济价值的种类。 前者是森林生态系统中最为常见的 一种昆虫病原真菌， 属世界性分布物种， 是害虫虫口自然调节的 重要因子和以菌治虫的重要生物防治材料 [2] 。因其具有致病性 强、寄主范围广、 对动物植物无害、 不污染环境及易培养的优点， 被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一 [3] 。 随着分子生物学技术的发展， 相关技术也开始广泛被应用于 昆虫病原真菌的分类和鉴定中。ITS （内转录间隔区Internal Transcribed Spacer ）ITS 区域序列的测定是目前真菌分类研究 的一项重要技术手段， 对于鉴定白僵菌及研究真菌属内和属间遗 传关系具有重要作用 [4-8] 。 ITS 区指的是 5.8S rDNA、18S rDNA 和28S rDNA之间的转录间隔区，因其进化相对迅速而具多态性 与保守性，对此序列的检测有助于分析菌株的遗传关系适合较低 水平的系统学研究，真菌的 ITS 序列长度一般在 550-750bp （碱 基对）。 ITS 序列主要被用于对不同生物型、菌株、种、属的分 类鉴定，也可用于研究近或低级分类阶元的系统发育。 本文以研究室保存的 8 株白僵菌菌株为研究材料， 通过对其 ITS 序列的鉴定，明确菌株的遗传背景，找出不同菌株间的遗传 差异，为进一步的研究提供准确可靠的研究材料。 材料与方法 1.1 供试菌株 随机选取 8 株于本实验室保存的球孢白僵菌菌株进行实验。 其编号分别为 Bb01-Bb08。 1.2 培养基 液体SDY培养基：蛋白胨1.0%,酵母粉1.0%,葡萄糖4.0%, pH值7.0;PDA培养基：200g 土豆去皮沸水煮 20min,取汁，葡 萄糖 2.0%,琼脂粉 2.0%。 1.3球抱白僵菌的DNA提取 挑取少量原菌，于SDY液体培养基进行活化，在 26C、 180r/min的摇床中，震荡培养 3-5d。从中吸取100卩I菌液于 PDA培养基，涂布均匀，于 26C环境培养3-5d。 参照朱衡等［9］的方法提取菌体总 DNA以0.8%的琼脂糖凝 胶电泳检测DNA质量。 1.4 ITS 序列分析 选取真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 进行本实验的 ITS 扩增反 应，由生工生物工程（上海） XX公司合成，弓I物序列为：ITS1: 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-ITS4: 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-以提取的基因组 DNA为模板， 反应体系（25卩l ）如下：1卩l DNA模板，12.5卩l 2 X PCRmix 上、下游引物各0.5卩l，用ddH2O补齐至25卩l - PCF反应条件： 94C预变性 3min;94 C变性 30sec, 55C退火 30sec, 72C延伸 1min, 35个循环;72 C最后延伸10 min;4 C保存。 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工 程XX公司测序。测序结果经DNAma软件进行多序列比对并建立 系统同源树。 结果与分析 实验结果 所提取DNA匀在加样孔附近呈现一致密亮带，基本无降解。 所提DNA较好，可以用于扩增反应。以提取的白僵菌菌株的 DNA 为模板，利用上下游引物进行扩增后，对其 PCF产物进行1%京 脂糖凝胶电泳，结果如图1示PCF条带与预期目的条带（600bp 左右）大小吻合。 图 1 ITS-PCF 凝胶电泳图 ITS 序列分析 利用DANMA的多序列比对，对8个供试菌株的ITS片段进 行比对拼接，经NCBI序列比对，证实这8个菌株都为球抱白僵 菌菌株。 根据聚类分析构建系统同源树（图 2）。结果表明 8 株球抱 白僵菌菌株的ITS序列同源性达到99%除BbO1、Bb08存在较 小差异，其他 6 株球抱白僵菌的 ITS 序列完全一致。 图 2 8 株菌株球抱白僵菌株 ITS 序列的系统同源树 讨论 一些球孢白僵菌菌株在形态、 生物学等方面非常相似， 如何 对这些菌株进行鉴定和区分， 是检疫实践中面临的首要问题。 随 着分子生物学技术的发展， 尤其是PCR技术的发展，在球抱白僵 菌的分子鉴定方面发挥着越来越重要的作用。 选择合适的靶序列 至关重要。 核糖体DNAITS区是核糖体DNA中介于18S和28S之间的转 录间隔区， 包括 ITS1 和 ITS2 两段序列， 它们在生物进化过程中 显示种的特征， 在种内具有高度保守性， 在不同种间又有不同程 度的变异，是最广泛