现代光学分析：第8章 多光子荧光-final version.pptVIP

RuNH2@AuNPs as two-photon luminescent probes for thiols in living cells and tissues Biomaterials,2014,35,9003. Schematic diagram of the release of the Ru(II) complex from the RuNH2@AuNPs via thiols displacement. Biomaterials,2014,35,9003. (a) Two-photon absorption cross section of RuNH2@AuNPs and RuNH2@AuNPs + RSH at excitation wavelengths from 700 to 1050 nm. (b) Logarithmic two-photon luminescence intensity of RuNH2@AuNPs + RSH as a function of the log pump power at 800 nm excitation. The solid lines are the best fit straight lines with slopes n =1.9775-2.0095. 33 多光子激发扫描显微成像系统的不足 ①.只能对荧光成像。 ②.如果样品包括能够吸收激发光的色团,如色素,样品可能 受到热损伤。 ③. 受昂贵的超快激光器限制, 多光子扫描显微镜的成本较高。 34 多光子激发显微镜应用举例 41 多光子激发光解笼与光激活 笼锁荧光素 追踪蛋白流动 核酸的运动 43 葡萄糖代谢－－NAD(P)H自发荧光 完整胰岛组织 光谱图 骨骼肌细胞 NADH在胞浆和线粒体中分布 优点：光损伤小，亚细胞信息，时间长 44 三光子激发成像 DNA三维形状：用DAPI（荧光染料）标记细胞核的DNA 多光子技术应用的早期研究成果 ①.钙生物学研究 与荧光探针技术相结合，多光子显微镜可以对细胞内的钙离子动态过程进行实时监测、对钙离子浓度进行准确测量，研究钙波、钙振荡现象同其他信号传导过程的联系，使对钙信号的研究从亚细胞层次深入到分子水平。 1994年，Piston和Webb用705nm的激光激发了分子探针Indo-1（单光子激发波长为355nm），获取了活细胞中的钙离子三维像。 1996年，他们又观察到了老鼠肌细胞局部自发钙离子释放现象。利用分子探针Indo-1和Fluo-3对钙离子进行了动态跟踪，观测到两种自发钙运动：从单个点向外传播的钙波和重复的、随机的从多个位置产生的钙“火花”（calcium sparks），并且测量了它们的传播速度和爆发频率。 多光子激发扫描显微镜还用于研究外界刺激或者其他离子、离子通道如钾离子通道对钙离子动力学的影响。 ②.神经学研究 在神经学研究中，Rose等首次用双光子激发对海马趾神经刺和锥状神经树中钠离子进行了瞬时动态测量。 Cox用双光子显微镜证明了动作电位能够影响神经轴，导致能够引起神经递质释放和目标神经突触激活的钙离子内流。 ③. 胚胎学与组织学研究 胚胎发育本身包含复杂的生命信息，对外界条件十分敏感。共聚焦显微成像往往妨碍胚胎发育，不能得到胚胎正常发育的信息。多光子成像非常适合胚胎发育的长期动态跟踪。 Squirrell和Wokosin等用多光子四维成像连续24h观察了hamster胚胎线粒体动力学，胚胎发育未受影响； 而对比实验中，共聚焦显微观察8h就抑制了胚胎发育的进行。 多光子能够获取深层次组织清晰的荧光图像，尤其适用于高散射介质的活体观测，具有其他光学显微镜不可比拟的优势。 共聚焦显微镜可以探测到牙齿表面下40μm处，而双光子的探测深度可以超过100μm。 Parasassi等利用双光子显微镜观察了Laurdan标记的纤维之间的细胞以及蛋白质自荧光，研究了小鼠主动脉血管壁横切面中氢氧化物诱导的蛋白水解过程。 40 Efficient Simultaneous Detection of Multiple Labels 胚胎发育过程的长时间动态观测 ④.分子生物学研究 利用某些报告基因，多光子成像可以在不破碎细胞前提下显示基因在生物体内的表达，已广泛应用于基因转染和表达研究。 Jakobs等利用双光子荧光显微镜跟踪了drFP583（或者称为DsRed，一种从热带珊瑚虫中提取的荧光蛋白）和GFP在活体大肠杆菌中的表达。 (2)EGFP (488nm) (1) DsRed（一种在热带珊瑚 虫提取的荧光蛋白）(568nm) Silmutaneous detection (925