分子克隆技术.docVIP

实验操作手册2005 生命科学技术学院 课程简介 分子克隆技术是指DYA的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技 术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开 设的实验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分 子克隆和分子杂交两大部分： 分子克隆技术：。\重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体 克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、 酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。 分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting, Northern blotting, Western blotting 及 Dot blotting 等。Southern blotting 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA,经过琼脂糖凝胶 电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固和 支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。DNA转移至同相支持物的过程屮各DM的相对 位置保持不变，用一定方法（如放射性同位素）标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分 析。本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼 脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上 研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。为让学生初步 了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供 选择。 TOC \o 1-5 \h \z HYPERLINK 或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）； 5） 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低 细菌的转化效率； 6） 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7） 一定范鬧内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比； 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组了导入细菌的过程。将连接产 物转化到感受态细胞屮，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种 方法筛选和鉴定H的克隆。 实验目的：拿握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。 实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。 实验原理：(1)热激法：大肠杆菌在0°C CaCl2低渗溶液屮，菌细胞膨胀成球形， 转化混合物中的DNA形成抗DNase的疑基一钙磷酸复合物粘附于细胞 表面，经42°C短吋间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富 培养基丄生长数小吋后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞屮, 重组子基因得到表达，在选择性培养基平板丄可挑选所需的转化子。 (2)电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿 孑L,不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。 同时DNA在电场屮形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 热激法转化实验步骤: 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基屮250 ^1 Amp (100mg/ml ), 250(11 X-gal (20mg/ml), 25 pl IPTG (200mg/ml),混匀后倒入灭菌培养皿小； 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 每100』感受态细胞加入约20ng质粒DNA, 3管分别加连接产物、标准超螺旋 质粒DNA邙H性对照)及不加入任何DNA (阴性对照)，用移液器轻轻吸打均 匀,在冰上放置30分钟; 热击：将离心管放置42°C水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1—2分钟； 复苏：每管加400MSOC培养基，在37C摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复 苏； 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal＞抗生素(Amp)的LA平板； 培养：倒置培养皿，于37C培养12-16小时即可观察到蓝白相间的菌落(其屮 白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子) 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 1 ?制备选择性培养基平板:在融化的250ml LA培养基中250 gl Amp (100mg/ml), 250 |il X-gal (20mg/ml), 25 pl IPTG (200mg/ml),混匀后倒入灭菌培养皿屮； 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 每管感受态细胞加入1卩1连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； 电转化仪选择1800