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2021/3/23 * 2）直接注射法（又叫微注射法） 　　 用此法进行基因导入时,通常先将原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点的琼脂糖中,或者用聚赖氨酸处理原生质体使之附着在玻璃平板上,也可以通过一固定的毛细管将原生质体吸着在管口,然后在显微镜下,将外源基因直接注射到细胞中去。采用该法已在烟草、油菜、苜蓿原生质体上获得了成功。显为注射装置由显微镜、显微操作仪和微注射仪组成。显微操作仪提供玻璃毛细管精确的位移,显微注射仪可以将pl的液体注入细胞。 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 3）基因枪法（又叫微射轰击法） 　　 这是由桑弗德（1987年）建立的,基本原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金颗粒表面,在高压下使金属颗粒喷射,高速穿透受体细胞或组织,使外源基因进入细胞的核中进行整合并表达。该法已使烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物细胞得到转化,缺点是仪器昂贵。 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 4）低声强脉冲超声波法 　　 利用超声波对植物细胞壁的物理作用,使植物细胞接收外源DNA。利用该法已经将GUS基因导入小麦幼穗愈伤组织,将Cat基因导入甜菜、烟草原生质体,均得到瞬间表达。处理的办法是将植物组织细胞和含外源基因的质粒DNA混合于缓冲液中,用超声波处理,然后培养植物组织细胞并再生,从再生的植株中选择出稳定表达的转化植株。 　　 5）花粉管通道法? 利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNA导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 6脂质体法(liposome) 　　脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA分子,然后与植物原生质体共保温。于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用,尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地纳入植物的原生质体。这种方法具有保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等优点。 2021/3/23 * 2021/3/23 * 7浸渍法 2021/3/23 * 转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白三个层面上。 1.DNA水平 southern 杂交;斑点杂交（dot blotting）:是在southern 杂交基础上发展而来的快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品直接转移到杂交膜上,然后再按southern 杂交法进行杂交;PCR。 2. RNA水平 Northern 杂交;RT-PCR（逆转录PCR）:先将mRNA转录成cDNA,再设计一对引物扩增杂交分子。 3.蛋白质水平 western 杂交,elisa等。 2021/3/23 * 　另一类转化体系是双元载体系统,由两个分别含T-DNA和Vir区的兼容性突变质粒构成的双质粒系统称为双元载体系统。二元载体系统是使用无毒的（disarmed）Ti质粒为载体。这种Ti质粒去掉了T-DNA区段中产生生长激素及生物碱的相关基因。因T-DNA核心基因的致瘤能力已经被缺失掉,所以进入植物细胞后,可以保证植物细胞能够正常分化,即能长出正常的植株来。 它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒即:微型Ti质粒（mini-Ti plasmid）和辅助Ti质粒（helper Ti plasmid）构成,T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上,通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。 2021/3/23 * 2021/3/23 * ? 由于克隆质粒既可以在大肠杆菌中复制又可以在根癌农杆菌中复制,可以很方便进行基因的克隆。 ??? 例如pBI121可以在大肠杆菌中大量扩增后,按质粒分离的方法进行分离和克隆操作。经对重组子的筛选分析,重组基因的质粒在大肠杆菌中制备出来,而后转入带有辅助质粒的根癌农杆菌,如LBA4404（pAL4404）,再以根癌农杆菌感染植物细胞,外源基因将在pAL4404?的Vir基因的帮助下,随着T-DNA从载体上转移到植物染色体。根据载体提供的选择记号的表型特征,就可选择出被外源基因转化的植物细胞。 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * 2021/3/23 * （4）工程化Ti质粒转入根癌农杆菌 a.直接转化 从大肠杆菌中分离重组的质粒,以质粒DNA直接转化根癌农杆菌。 对数生长期的根癌农杆菌离心收集后以CaCl2悬浮,置液氮中