生物化学实验一：蒽酮比色法测定糖含量.ppt

(2)糖元水解：加1ml水和1ml 1M H2SO4于离心管内，管口放一小漏斗以减少蒸发，在沸水中加热1-2 h，取出冷却后，将溶液倒入50ml量瓶中，以少量的水多次洗涤离心管，洗液一并加入量瓶中，加酚红指示剂一滴，用1 N NaOH 中和(至淡黄色)，最后用水稀释至刻度，其液即为待测葡萄糖的未知液。 样品液的测定：(1)取4支试管，按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却,加完要摇匀) 表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定 单位：ml 试管号 1 2 3 4 样液 0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水 1.0 0 0 0 蒽酮 4.0 4.0 4.0 4.0 A620nm (2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。 (3)以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。 3．结果计算： C×V w = ————×100% ?????????????????????????? m， 式中w：糖的质量分数（%） C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml） V：样品稀释后的体积（ml） m：样品的质量（ml） 六、注意事项 1、该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入杂质。 用蒽酮法测出的糖类含量，实际上是溶液中全部可溶性糖类 总量，有特殊的应用价值，但在测定水溶性糖类时，则应注 意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞 壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测 定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度各异，果 糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显 色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造 成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。 2、 H2SO4要用高纯度的。 3、不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。 4. 一定要注意温度要控制在100℃，从100℃开始准 确计时10min,然后迅速冷却，于室温中平衡10min.加 热、比色时间应严格掌握。 5. 蒽酮要注意避光保存。配置好的蒽酮试剂也应注 意避光，当天配制好的当天使用。 6. 试管要保证干燥清洁，无残留水滴。 思考题： 1、制作标准曲线时应注意哪些问题？ 1)标准曲线是直接用标准溶液制作的曲线,是用来表述被测物质的浓度(或含量) 与分析仪器响应值之间定量关系的曲线。样品的浓度等指标是根据标准曲线计算 出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则 后面的实验结果无从谈起。??2)设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较 大的跨度，并且要能涵盖所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线 浓度范围之内，包括上限和下限,标准曲线不能任意延长 ,而对于呈S型的标准曲 线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。 3)最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样 品的浓度不会出现较大的偏离。4)检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以 减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。5)标准曲线的样品数一般为7个点， 但至少要保证有5个点。6)做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变 动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是 0.999。7）要重复测定取平均值，消除分光光度计设备的影响。 2、用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么？为什么? * 例如：分光光度计的使用，蛋白质浓度测定方法 * * * * 商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班 Xiamen University 厦门 翔安 2016年02月25日 实验一：蒽酮比色法测定糖含量 Xiamen University 生物化学实验 2016年02月25日 厦门 承担本门课程的老师： 艾春香 丁少雄 周涵涛 教辅：郭立梅 教助：唐未 地点：希平楼C1-304# 生物化学—用化学的原理和方法，研究生命现象的学科。研究生物体中的化学进程。 其任务主要是了解生物的化学组成（如蛋白质、糖类、脂类、核酸等生物大分子）、结构及生命过程中各种化学变化。 例如：蛋白质研究——电泳技术，柱层析技术 生物学各分支学科 生物工程 工业 环境科学 医药 农业 生物化学实验技术 生物化学实验课的目的任务 介绍生物化学实验技术的原理和操作方法 掌握技术方法原理，熟悉并掌握操作技能 模拟科研的方法组织教学 培养学生的动手能力、综合能力及创新