生物化学实验七：蛋白质含量的测定.ppt

* * 我 * * 我 商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班 Xiamen University 厦门 翔安 2016年03月31日 实验七、蛋白质含量的测定 Xiamen University 生物化学实验 2016年03月31日 厦门 蛋白质概述 定义 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。 主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些 蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 蛋白质的含氮量比较恒定，平均为16%，因 此可通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质 含量。 蛋白质概述 蛋白质是生物体最重要的生化物质之一。 功能： (1) 催化：酶是蛋白质，决定了代谢的类型。 (2) 激素：多肽激素，有调控作用 如胰岛素调节血糖浓度。 (3) 载体：如血红蛋白，可运载O2和CO2； 无脊椎动物的血蓝蛋白功能一样； 在6000m高山上发现有蓝血人； (4) 运动：肌肉中的肌球肌动蛋白，伸缩功能。 (5) 免疫：引起免疫的抗体是蛋白质，称免疫球蛋白。 蛋白质概述 (6) 光合作用：叶绿体蛋白。 (7)保护作用：毛发、肌腱、韧带、软骨等。 (8) 凝血作用：凝血蛋白。 (9)通透作用：生物膜，表皮内在蛋白。 (10)毒素作用：肉毒毒素等。 (11)遗传讯息调控：受体蛋白、视觉蛋白、味觉蛋白。 (12)精神蛋白：预测 (13)重要的能量来源 关于氮-pro换算系数 对于氮含量换算成pro含量的系数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。 一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算系数以何物代替。 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 蛋白质的测定方法分两大类： 具体测定方法： 凯氏定氮法:最常用的， 国内外应用普遍。 双缩脲反应 染料结合反应 酚试剂法 国外： 红外分析仪 凯氏定氮常量法、 半微量法和微量法 微量凯氏定氮法 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 蛋白质含氮量通常在16 %左右，将凯氏定氮法测得的含氮量乘上蛋白质换算系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 消 化 CO2+SO2+H2O+NH3 ↑ +浓H2SO4 N NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸 馏 H2O+Na2SO4+NH3↑ (NH4)2SO4+NaOH 吸 收 NH3+H3BO3 NH4HB4O7+H2O 滴 定 NH4HB4O7+HCl+H2O NH4Cl+H3BO3 消化炉 蒸馏单元及电位滴定仪 原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而 形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合 物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结 构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一 定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质 定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1- 10mg 双缩脲法 540 nm Folin-酚试剂法(Lowry法) Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高(20-250?g)、较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 紫外分光光度法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 总蛋白定量分析－BCA(Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉) ?准确灵敏：BCA试剂的蛋