生物化学实验四：氨基酸的纸上层析.ppt

商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班 Xiamen University 厦门 翔安 2016年03月17日 实验四：氨基酸的纸上层析 Xiamen University 生物化学实验 2016年03月17日 厦门 一、实验目的 1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。 层析技术(chromatography 色谱技术) 一、发展史： 层析分离技术在20世纪初就已得到应用： 1903年用于植物色素的分离； 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。 二、实验原理 层析技术， (chromatography 色谱技术) 是利用被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度在流动相和固定相中进行分配，最终达到分离目的。 层析技术的种类 1、按流动相的状态分类： (1)液相层析(色谱) (2)气相层析(色谱)； 2、按固定相的使用形式分类： (1)柱层析(CC) (2)纸层析(PC) (3)薄层层析(TLC)； 3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类： (1)吸附层析 (2)分配层析 (3)离子交换层析 (4)凝胶层析 (5)亲和层析等。 纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。缺点是展开时间较长。 常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附的水相为固定相, 有机溶剂相为移动相。 由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多,移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开 分配层析法： 利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数α是一个常数即: α=溶质在固定相的浓度（Cs）/溶质在流动相的浓度（Cl） 在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。 Rf值的定义为： 原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离 影响Rf值的因素有： ①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。 影响Rf值的主要因素： Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物 质分配系数不同，Rf也就不同。 （1）物质的结构和分子极性： 物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也 就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间 的分配情况，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf 小；反之,Rf则较大。 （2）层析溶剂： 首先，溶剂的纯度要高,否则需经预先处理（酸碱抽提，重蒸馏，脱水干燥等）； 其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85，样品被分离物质的组分的Rf之差最好大于0.05； 再次，有些溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久放易引起酯化. （3）pH值： 溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变； 溶剂的pH还可以影响流动相的含水量，溶剂的酸碱度大，吸水量多，使极性物质的Rf增加（将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理）. （4）滤纸： 层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相