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DNA 序列分析技术 物种的遗传多样性在本质上是 DNA 一级序列的多样性。近年来，随着 DNA 测序技术的迅 DNA 测序方法。速发展和日益普及， DNA 测序在遗传多样性的研究中正在起着越来越大的作用。本章将介 DNA 测序方法。 1 DNA 模板的制备 在遗传多样性的研究中， 由于样本量一般都较庞大， 因而 DNA 测序的速度就成了很关键的 因素。因此，这类研究中常常直接测定纯化的 PCR 双链产物而不大采用克隆技术。本节介 即低熔点胶回收法。绍本实验室常用的从 PCR 产物制备测序模板的方法， 即低熔点胶回收法。 5cm 左右处切下宽(1)制备1.5 %?2.0 %的琼脂糖凝胶，待其充分凝固后，在离点样线 约 1cm 5cm 左右处切下宽 2)低熔点胶凝固后，将待纯化的 PCR 反应液全部点样，恒压 100V 左右进行电泳，直 至扩增片段进入到低熔点胶中部。在 360nm 紫外光下，将已进入低熔点胶的条带切下，放 入 1 ． 5ml 离心管中。 (3)离心，将胶块压缩到管底，然后补加 TE至500讥 于68 C水浴，将低熔点胶熔化, 再迅速加入等体积的水饱和酚并混匀。 4)室温下振荡抽提 10 分钟，再 12 000r ／min 离心 10 分钟。取上清液再用氯仿 -异戊 醇( 24:1 )抽提 5 分钟。 5) 12 000r／min 离心 10 分钟，取上清液，在其中加入 1／10 体积的 10 moI／ dm3NH4Ac和2倍体积的无水乙醇，置 一70 C下沉淀半小时以上。 6)再12 000r ／min 离心 10 分钟， 沉淀用 70 %的冷乙醇洗涤； 再次短暂离心后小心地 倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入 20?50卩ITE缓冲液或无菌去离子水中溶解，即为制好的 DNA 模板。 目前还有一些非常有效的商售试剂盒可用于纯化 PCR 产物， 如 Oiagen PCR 产物纯化试 剂盒等，但成本较高。 2 手动 DNA 序列分析技术 2.1 测序胶的制备 按以下配方制备测序电泳胶： 6%胶工作液 70ml 10 %过硫酸胺（APS ） 70卩1 （新鲜配制） TEMED 70^1 将上述溶液混合后，灌入准备好的胶板中， 将鲨鱼齿”梳子反插入胶，深约0.5?1.0cm。室 温下聚合 1 小时左右。 12.2.2 测序反应 测序试剂盒购自美国 USB 公司，测序酶为 Sequenase Version 2.0 ; a 35SdATP 购自美 DuPont公司（ImCui / 100卩）。测序反应按 USB推荐的方法进行: 1 ) DNA 模板混合液( 0．5ml Eppendorf 管)： DNA模板7卩1 测序引物1卩1 5 倍 Reaction buffer 2 1 NP40 1 卩1 2 ）标记混合液（每一反应的量） : DTT (0.1mol /dm3 ) 1卩1 1／5dGT P labelling mix 2 Enzyme dilution buffer 1.75 NP40 0.55 1l 去离子水 0.375 1l 测序酶 0.1251l 35S- dATP 0.5 1 3) 3) ddNTP ( ddA、ddG 、 ddC 、ddT) 2.51l 4）退火反应（ annealing ）:将 DNA 模板混合液煮沸 3 分钟，迅速放入乙醇和干冰的 混合冰浴箱中退火 30秒左右（如无干冰，则用冷冻于- 20 C?—70 C下的无水乙醇，临 用前由冰箱中取出）。在进行标记反应之前，反应液需保存于干冰或碎冰中。 5）标记反应（ labelling ）:由干冰或冰中取出经退火的 DNA 模板混合液，放在手中使 其融化，然后加入 5.51 l 的标记混合液。 在微型离心机上离心 10?15 秒后，置室温中 1 分 钟。（ 6）链终止反（ termination ）:将上一步骤制成的混合液以每管 3.31 l 分装入预先在 37 C下温浴的加有ddNTP的管中，并在37 C下反应4?5分钟。 7 )每管加入 41 l 终止液( stop solution )。 2.3 电泳 电极缓冲液 1 倍 TBE（ pH 值 8.0） 预电泳30 分钟至 1 小时恒温方式测序胶板上夹盖铝恒温板电泳温度50 C 预电泳 30 分钟至 1 小时 恒温方式 测序胶板上夹盖铝恒温板 电泳温度 50 C左右 电泳条件 恒功率 90?110W 电泳时间 2.5 小时至 5 小时 2.4 干胶制备和压片 1 ? 1 ? 1.5 小时。制好 滤纸在胶上贴紧，使胶粘在滤纸上，然后将胶放置于干胶器中制备干胶 的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将X 光片压于胶上曝光 的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将 X 光片压于胶上曝光 2 ? 3 天。