生化实验六过氧化氢酶米氏常数的测定.docx

过氧化氢酶米氏常数的测定 生命科学学院11级拔尖班 111070094 张茜 实验目的 了解米氏常数的测定方法 学习提取生物组织中的酶 实验原理 实验中的反应 H2O2 被过氧化氢酶分解出 H2O 和02,未分解的H2O2 用KMnO 4 在酸性环 境中滴定，根据反应前后的浓度差可以算出反应速度 ： 酶 2H 2O2 -f 2H 20 + 02 2KMnO 4 +5H 2 O 2 +3H 2 SO 4 - f 2MnO 4 +K 2 SO 4 +8H 2 0+50 2 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶 ，以1/ v?1/[ S]作图求Km . 米氏反应动力学 米氏方程(Michaelis-Menten Equation) r i1K物HM r i 1K物 HM 詁 ［脑｝ 0.15 I.S H0； 9 甘調骼氨跌甘飜 im 舷淮 捕 35* 丙冊 MftSM tar L-糊 5 常见的一绅的Kji 底物浓度同对酶反应速度的影响米氏方程心芒喘 米氏幣数h#的求法 米氏幣数h#的求法 I-直规作圈楚:v-|S| 反映擦的神类：心是一种静的特征常數只与■的 种类有关.与薦浓厘、底物池应无关. 1米氏常数K.是醉促反应达到最大反应速摩、昨一半 时的底椰瑕度”其数値大小应映了酶与屁狗之间的 亲和力：％恒越大，亲和能力越弱.反之叽值越 小*亲利能力越强° g可用来判断辭1号功能解)的晟适底物：值最 小的酶促反应对应的底物就是该飾的绘适底物＜■ 米氏常数K”的求建 2.双倒数作图法：l/v^l/|S| v /斜率=令- 1 K I 1 + ■■工 v 隘IS]陰工 / * 1 _卡 J_ n J_ K(n l|S| l.irH^iiivi r- RuiSi双倒數作詔滋 该件圉法应用最广“怛在低浓度时、恒俟差较大.在［旳等差 值实輪開作图点较集中于纵轴?丙此吾设计底物浓度时，童好将 I?］JG成尊蓋栽列，这样可恢恵距较为平均.再配以耐小一柔阿 归袪「试可得剁綾为澀确的蜡果 米氏常数K枷的求法 3. HsmeiWglT件图法 [S| V / 声1 一 ￡ [S] /料率一- Y V \「 nn3 寓 m? y f J ■ J, -K* 0 | 曹| Il;im-s-\\ uulffj-图法 此法优庶足横轴上点分布均匀.缺点是⑴会放犬优护。同 时刈底物浓度的选择有要求。罔“耳时图形近*水半线， |S|?Kni肘夜线将在棕自附近与轴相交. 米氏常数匕”的求法 4-其他作图法 4-其他作图法 实验试剂 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.0）: 实验室提供 酶液：称取马铃薯5g,加缓冲液10mL,匀浆过滤. 0.01107mol/L 高锰酸钾? 0.098mol/L H2O2. 25%H 2SO4. 四、 实验操作 取6只锥形瓶，按表1的顺序加入试剂. 先加好过氧化氢和蒸馏水 ，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间 . 反映到达5min 立即加入硫酸终止反应 ，充分混匀.用0.0109mol/L 的KMnO 4 溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色，记录消耗的高锰酸钾体积. 瓶号 试剂/ml 0 空白 1 2 3 4 5 0 1.00 L25 1.67 25 5,(M 蒸憎水 9.50 50 8.25 7.83 7.0 4.50 酶液 (LSO (L50 0.50 0.50 (E50 0.50 汹定用去）_） v0 % Vi V4 vf 样品实际消耗的 KAInO4 —? 一几 v2-v0 v4-v0 v5a;  五、 实验结果与讨论 1.实验结果 AvV 口 吕号 0 1 2 3 4 5 实际消耗KMnO 4/mL 0.00 2.99 3.93 5.44 7.94 15.89 v/(mmol/mi n) 0 0.00474 0.00367 0.00546 0.0073 0.00844 [S]/(mol/L) 0 0.0098 0.0123 0.0164 0.0245 0.0490 1/ v — 327.8 364.0 381.4 197.9 99.5 1/[ S] — 102.0 81.6 61.1 40.8 20.4 表2:实验结果和计算结果 双倒数作图 ? 99.5100 ? 99.5 100 50 0 1/v 线性线 0 20 40 60 80 100 120 Km = 斜率/截距=0.03479