第二章土壤微生物.pptVIP

2021/3/26 * 二、土壤微生物的原位研究 维诺格拉德斯基在20世纪早期就指出,如果只研究微生物纯培养,即使某天能够把土壤中的微生物种类全部分离出来,也只能是获得一套不能说明它们在土壤中活动规律的菌种。 2021/3/26 * 许多土壤微生物在实验室培养基上表现的性状和生活规律同它们在土壤中的表现可能很不相同。 例如,一般慢生型大豆根瘤菌在实验室具有丰富养料的培养基上生长时,世代时间通常为6 —8h,而采取特定方法测定它们在土壤中世代时间则长达3 — 5天。 根瘤菌在土壤中的代谢活性也同它们在培养基上生长时有差别,它们在原位条件下能够利用更多的糖类。 (一) 原位研究的意义和必要性 2021/3/26 * 大豆根瘤菌的某些基因只有在土壤中才会表达。研究者己从豌豆根瘤菌中分离和鉴定出根际表达基因(命名为rhi ABCR基因)。当不存在nod FEL基因时,rhi基因影响小巢菜(Vicia hirsute)结瘤。rhi ABCR基因构成一个操纵子,由rhi R基因来调控。它们的产物影响其与寄主的关系。 2021/3/26 * (二)模型生态系统的应用 理想化的原位研究是在田间观察微生物的活动规律及其在土壤肥力和植物营养等诸方面的作用,可是直到最近才出现微电极和光导纤维等个别方法在田间进行原位测定。 微生物研究工作不可能都在田间进行 2021/3/26 * 模型生态系统(model ecosystem)方法,或称缩影(microcosm)方法是实验室纯培养研究和田间直接观察之间的桥梁. 模型生态系统:包括从自然生态系统中取回到实验室的完整土样(或其它研究对象),应尽可能地避免扰动和破坏;也可以根据研究目的而模拟构建的自然生态系统。 模拟不是拼凑,不是一般的多种微生物混合培养,它具有自然真实性,即应该是大自然生态系统的一个缩影,应尽可能地具备自然情况下的正常结构和功能。 2021/3/26 * 缩影方法也不是简单地把自然小样本搬到实验室研究,有时需要对某些次要环境因素作些简化或舍并,但在主要方面仍要保持高度的真实性。 例如,某种土壤缩影,根据研究目的可以只包括该种土壤的主要成分,有些物体在田间条件下虽然经常出现,而进行室内缩影研究时则可省略,如土表的昆虫或微小脊椎动物。 在进行缩影研究时最好尽量精确地模拟自然生态系统。 2021/3/26 * 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor) 抗性基因 Kanamycin,Neomycin均属脱氧链霉氨基葡萄糖苷类抗生素,可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化,使之不能进入细胞内。 2021/3/26 * 抗生素抗性作为检测标记具有简便、快速、费用低、实验结果可以进行统计分析等优点。 由于土著微生物中的某些微生物会产生不同程度的天然的抗性,对目标微生物菌数的测定会有影响。 如选择两种或两种以上抗生素基因标记,则测定结果非常可靠。 为了防止抗生素抗性基因的扩散,生态学研究中通常不采用抗生素抗性基因,即使要用,也尽量不要采用人类疾病治疗常用的抗生素相应的抗性基因。抗生素抗性基因不要标记在质粒上（因为质粒容易扩散）,而要标记在染色体上 2021/3/26 * 2、显色基因 其表达产物（酶）可催化某些易检测的生化反应,如lacZ, GUS 2021/3/26 * β-半乳糖苷酶基因lacZ 带有lacZ的微生物在含有底物5-溴-4-氯-3-吲哚一半乳糖苷（X-Gal）的平板上或溶液中使菌落(菌体)变成蓝色,检测直观 Background: activity Visible only in big amounts of cells (colonies) 2021/3/26 * 2021/3/26 * 邻苯二酚2, 3一双加氧酶基因（xylE） XylE催化邻苯二酚产生黄色的产物——使得标记菌的菌落呈现黄色 2021/3/26 * β—葡萄糖苷酶基因(gus) 该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷衍生物的水解酶。它的适用范围十分广泛,因为许多生物中没有这种基因。 gus基因(3’端) 与其它结构基因形成融合基因后仍可以正常地表达,所产生的融合蛋白仍然具有GUS活性。 2021/3/26 * ①在一定条件下与X-G1ucuronic acid （5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid）底物发生作用,产生蓝色物质,既可以用分光光度计法测定,又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。 ②当加入4-甲基伞形酮基-葡萄糖酸苷时生成4-甲基伞形酮,发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于