型钙离子通道阻滞剂贝尼地平对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体内外.docxVIP

博士学位论文司)，胎牛血清(Gibco公司)。 博士学位论文 司)，胎牛血清(Gibco公司)。 2．BMSCs的提取与培养 小鼠寰枢椎脱臼处死后75％酒精浸泡消毒5分钟，在超净台中用眼科剪和 眼科镊剥开小鼠皮肤，从髋臼关节处取下小鼠双下肢，PBS清洗掉粘连毛发， 剥离附属肌肉等软组织整理出股骨，浸泡于0【．MEM基础培养基中，用一套新的 灭菌眼科剪和眼科镊剪开股骨双侧骨端暴露骨髓腔，用1 ML注射器吸取 10％FBS的完全培养基冲出骨髓，反复并两端交换冲洗，待骨头发白后将含有骨 髓的完全培养基转移至干净的15 ML离心管，800 r／min低速离心5分钟，骨髓 重悬后转移至10 cm培养皿中5％的C02下37。C培养，培养基3天更换1次。 3．细胞实验的分组与处理 取第3代生长良好的小鼠BMSCs按1×10 5个／孔密度接种于6孔板，待细 胞融合率达到90％以上时，将细胞分为2组，对照组：成骨诱导培养基培养； 贝尼地平处理组：成骨诱导培养基条件下分别以l、10和100 gmol／L贝尼地平 培养。成骨诱导培养基各成分比例为100 nmol／L的地塞米松，50 lag／ml的维生 素C磷酸酯，10 mM／L的p．甘油磷酸钠。药物连续处理14天，3天更换1次培 养基，370C，5％C02条件下培养。 4．CCK8检测贝尼地平对BMSCs的细胞毒性 第3代BMSCs种于96孔板中，细胞的种植密度为1×105个／孔，培养2天 后对细胞进行加药处理，加入贝尼地平浓度分别为0．1、l、10、100和1000 Iunol／L， 加药处理1天，使用Caspase．8比色测定工具包(CCK8)进行药物细胞毒性检 测。每孔加入10止的CCK8溶液和90此的Ⅱ．MEM基础培养基，使用酶标仪 测量各孔吸光度(optical density,OD)，CCK8溶液吸收波长为450 nm。 5．ALP染色实验 第3代BMSCs种于6孔板中，细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100 IJmol／L) 处理14天后，对细胞行ALP染色。具体步骤为：洗去细胞培养基，使用无菌 PBS轻柔冲洗2次，每孔加入2 ml的4％多聚甲醛室温固定20分钟；PBS冲洗 III 万方数据 摘要3次，每次3分钟，洗掉多余多聚甲醛；按照使用说明书配制ALP染液，现配 摘要 3次，每次3分钟，洗掉多余多聚甲醛；按照使用说明书配制ALP染液，现配 现用，配好ALP染液避光保存；每孔细胞加入ALP染液1 ML避光370C孵育 半小时；PBS冲洗3遍，每遍3分钟，终止染色。光镜下拍照，Image．Pro Plus software(IPP，美国)软件计数阳性细胞数。 6．Western blotting检测Runx2、OCN、GAPDH、p-catenin和LRP5的表达水 平 对细胞成骨诱导并加入贝尼地平(1～100 lamol／L)处理14天后，在冰上用 蛋白裂解缓冲液裂解细胞，收集蛋白，样品金属浴960C处理10分钟，10000 r／min 高速离心1分钟，取上清，-20。c长期储存备用。每条泳道上样30嵋蛋白，用 体积分数(VⅣ)为10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳60分钟，将凝胶中蛋白电泳转移 至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉常温封闭1小时后分别加入一抗(1：2000)冰箱40C 过夜孵育，室温TBST溶液清洗3遍，每遍5分钟，二抗(1：3 ooo)常温孵育1 小时，增强化学发光(ECL)发光试剂显色摄像。条带用Image J软件分析，测定 灰度值。目的条带与对应的GAPDH条带灰度比值为统计结果。 7．动物材料 雌性10周大C57／BL6小鼠，体重20～239，购至内蒙古农业大学实验动物 中心；主要实验仪器与试剂：(1)主要仪器：倒置光学显微镜(Nikon，TE2000．U)， 荧光显微镜(Olympus，FV-1000)，显微CT(SCANCO Medical，pCT80)，石 蜡切片机(Leica公司)(2)主要试剂：一抗Runx2(CST公司)，一抗OCN(CST 公司)，偶联异硫氰酸荧光素山羊抗兔二抗(Abcam公司)，伊红(Sigma公司)， 苏木素(Sigma公司)，乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine TetraaceticAcid，EDTA， Sigma公司)，甘油(Sigma公司)，余试剂均购至Sigma公司。 8．动物饲养与造模 随机将30只lO周大C57／BL6小鼠平均分为3组，分别为：假手术组(Sham)， 去卵巢组(0VX)，去卵巢加药组(OVX+BD)；假手术组切除卵巢周围少量脂 肪垫后缝合，去卵巢组完整切除双侧卵巢，去卵巢加药组在完整切除双侧卵巢 IV 万方数据 博士学位论文后灌胃贝尼地平20mg／kg／d，正常饮食，