细胞生物学检测.pptVIP

* 制备双层软琼脂培养检测克隆形成率模式图 * 软琼脂克隆培养 * 软琼脂培养法克隆形成率的影响因素： ? 细胞性质：如原代培养和传代培养，正常细胞和肿瘤细胞。（克隆形成率反映细胞的群体依赖性和增殖能力）  ?接种细胞的密度：细胞密度不能太大，以免细胞克隆界限不清(接种细胞密度不应超过35个/cm2) 。 ? 其他因素：如温度、pH、营养成分、底物等。 ? 细胞状态：一定要处于半对数生长期。注意： ①?细胞小群中的细胞数不应小于20个。 ② 一定形成单细胞悬液。 ③细胞密度不能太大，以免细胞克隆界限不清。 ④选用指数生长期的细胞。 6. 流式细胞仪（Flow cytometer, FCM）检 测细胞周期 * 细胞周期：由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。 ① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间； ② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； ③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 原理： 流式细胞术分析细胞周期是依据细胞DNA含量进行分析。 细胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。 PI不能透过完整细胞膜，染色前需将细胞固定。 * 方法： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，PBS洗涤两次。 将细胞重新悬浮在500μl PBS中，避免形成细胞团块，加入预冷的75%乙醇（1-2×106/ml），于4℃固定过夜。染色之前细胞在4℃固定可保存至3周。 离心弃固定液，加3ml PBS重悬细胞沉淀。 300目筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃PBS。 加RNase至终浓度100 μg/ml ，37℃作用30min后,加PI染液至终浓度50 μg/ml，4℃避光30min。 流式细胞仪检测，488nm检测荧光。 * 结果 * 细胞周期 G2 M G0 G1 s 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA分析 DNA含量 细胞数量 2N 4N  * 纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；横坐标DNA Content：即DNA含量； 可检测到各期DNA含量平均值，各期细胞数占总数的百分比；如S期百分比高于对照组，说明细胞增殖活力强。 　　 五、细胞运动、迁移和侵袭检测 * 1、Transwell小室 迁移和侵袭实验 Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert）外形为一个可放置在孔板里的小杯子，杯底层有通透性膜，多为聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane），膜孔径大小0.1-12.0μm ，迁移和侵袭一般选择8μm孔径。 原理： 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。 * 迁移实验 上室培养液为不含血清的培养液，24孔板小室接种1-10×105 个细胞，体积200μl。下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养液。 培养12-24小时后，取出Transwell，用棉签擦去膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛或乙醇室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，显微镜下观察细胞，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。 * 侵袭实验 与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。 基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，在37℃呈胶状。 * * （3） 单层细胞固定观察的特点: ① 细胞层次少，固定穿透快，固定效果好。 ② 单层细胞不需包埋和切片。 （4） 培养物的准备和固定前处理： ① 盖玻片单层培养时，固