园林植物组织培养 (7).pdf

第2节 基因组与cDNA文库构建  园艺植物基因组文库构建  园艺植物cDNA文库构建 1、园艺植物基因组文库构建 1.1 基因文库定义及类型 定义: 一组DNA或cDNA序列克隆的集合体 类型： 基因组DNA文库：来自基因组全部DNA片段组成的基因文 库，反映基因组全部遗传信息  cDNA文库：将某特定组织表达的mRNA反转录成cDNA组 成的基因文库。每克隆1种mRNA信息，足够数目则全部 mRNA信息 1.2 构建植物基因组文 库需满足的条件  文库能够覆盖整个基因组  插入的DNA片断比较大  文库易于保存且较稳定 基因组文库构建流程 1.3 载体制备 重组子数目 完整基因组文库所需筛选的  N ＝ln(1-P)/ln(1-f ) N ：重组子数量 ；P: 概率 ；f: 某一插入片段与相应基因组大小的比值 8 例：以0.99概率获得番茄基因组（9.5×10 bp ）20kb 插入片段 ，所需筛选的重组子数目： 4 8 5 N ＝ln(1-0.99)/ln[1-(2×10 /9.5 ×10 )]=2.2 ×10 载体选择  质粒载体：承载~15kb DNA片段 (有效范围10kb)  载体： ~25kb DNA (有效范围15 kb)  Cosmid 载体：~45kb DNA(有效范围40 kb) 载体制备要求  纯度高 （不高-重组克隆含细菌基因组DNA ，影响文库质量）  去磷酸化效果好 （提高载体-目标片段连接效率 ） 1.4 高质量基因组DNA提取和部分酶切 要求 ：提取DNA相对分子量至少是文库最终平均插入片 断长度的3-5倍 如插入片断100kb以上，则要求提取的gDNA分子量要 到500kb以上 提取gDNA分子量越大 ，重组克隆的插入片断越大 基因组DNA的不完全酶切 1 ）根据需要选择合适的限制性内切酶 a) 识别位点4个的限制酶出现几率: 1/256 44 b) 识别位点6个的限制酶出现几率: 1/4096 46 2 ）分离目的酶切片段大小 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族：20kb 3 ）DNA不完全酶切条件 a) 确定酶用量 ，改变酶切时间 b) 固定时间 ，改变限制酶用量 1.5 酶切片段与克隆载体连接 1.5.1 酶切片段分离纯化 １）低熔点琼脂糖回收目的片段 65℃ ２）目的片段回收 1.5.2 酶切片段与克隆载体连接 连接体系中4种连接方式 • 载体自连 • 载体和gDNA片段连接 所需要的 • gDNA片段自连 • 基因组片段之间连接 提高载体--gDNA片段间连接效率： 通过调整载体与gDNA比例 达到较好效果 1.5.3 载体的遗传转化  电转化 转化大肠杆菌最普通手段  插入片段越大 ，转化效率越低 1.5.4 克隆挑取、验证  从文库中随机挑选一定量克隆 ，摇菌，提质粒DNA ， 酶切后脉冲电泳检查插入片段大小 ，并计算空载率  细胞器DNA污染会降低文库实际容载量 1.6 gDNA文库克隆子保存与筛选 gDNA文库的保存