园林植物组织培养 (9).pdf

第3节 基因克隆的主要策略 基于基因产物的克隆 基于基因差异表达的克隆 基因序列同源克隆法 基于图谱的基因克隆 基因标签法 一、基于基因产物的克隆  将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,测出一段多肽N端aa序 列 ，合成相应nt序列 ，以此为探针从gDNA/cDNA文库 中筛选出相应的基因 马铃薯中克隆编码柱头识别蛋白的基因  按aa序列C与N端设计引物 ，用PCR扩增出编码特异蛋 白的DNA片段 以cDNA为模板从辣根中获得HRP －C基因 二、基于基因差异表达的克隆  生长发育衰老等生命活动过程中，不同基因存在选择性表 达 ，利用反向生物学原理克隆新基因，尤其是发育基因  转录水平差异表达基因研究 方法较多，如差异筛选、减 法杂交、DDRT-PCR、代表性差异分析（RDA ）、抑制消 减杂交法（SSH ）、基于基因芯片的差异分析、DGE （NGS ）、SAGE、RCGS等 DDRT-PCR mRNA差异显示法(mRNA Differential Display PCR) 利用PCR放大差异来鉴别与克隆差异表达新基因 优点: 快速、灵敏、简单，低丰度mRNA 应用: 研究基因表达、基因鉴定与克隆、激素对植物发育影响、 植物发育过程、次生代谢途径以及抗病抗逆 如番茄TMV抗性基因Tm -2a、成熟相关基因、拟南芥臭氧诱导基因 AtOZI1、马铃薯块茎发育基因LoX、马铃薯块茎发育相关cDNA片段 （TDF536、TDF531 ）等 基本步骤  从不同植物或组织中提取总mRNA  用Oligo(dT)12MN为引物(其中M ＝G/C/A ，N ＝G/C/T/A) ， 在反转录酶作用下，将mRNA反转录成cDNA  用与反转录相同的锚定引物和由10 碱基组成的随机引物对生成 的cDNA进行PCR扩增  PCR产物通过变性PAGE电泳分析 ，找到差异表达cDNA条带  回收差异条带，将其作为探针进行Northern杂交或筛选cDNA 文库，获得差异表达的基因全长 mRNA差异显示技术示意图  差异条带回收、克隆与测序 T-A克隆 ，α-互补法蓝白斑筛选 ，阳性克隆鉴定、测序 Fig . mRNA DD-RT-PCR Fig . Re-amplification  优点  在基因序列未知情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因  缺点  假阳性特别高--可达70%  技术重复性较差  较小,不能代表差异表达的基因  只能扩增靠近Poly （A ）mRNA 3’端不大于600 bp 区域  不能用于低拷贝的mRNA