核酸的凝胶电泳.pptxVIP

第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel Electrophoresis;Content of Table;前 言;核酸凝胶电泳的基本原理;一、 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis;（一）凝胶的制备及电泳;;（二）DNA的迁移速率决定因素; 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； ; 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和??度增加。; 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；; 不同类型琼脂糖的性质;不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围; 7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE;TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较;（二） 凝胶载样缓冲液;6×凝胶载样缓冲液;（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测;1 凝胶的EB染色;使用EB染色注意事项; （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。;（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。;2 凝胶SYBR Gold的染色;（四） 凝胶中DNA的成像;（五） 凝胶中DNA的回收;二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE;; 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。;CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） ;（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类; 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。;（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围;三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE;为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。 ;（一） PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。;;（二）PEGE类型;;（三） 影响分辨率的因素;3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。 4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。;不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围;2 凝胶SYBR Gold的染色;二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE;;CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） ; 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。;（二）PEGE类型