核酸分离和纯化.pptxVIP

1 核酸的分离和纯化 2 找答案？ 核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？ 核酸制备基本步骤？ 如何鉴定核酸浓度和纯度？ 核酸的保存方法有哪些？ 3 前言 核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 4 核酸的分类： DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 5 主要内容 1. 核酸分离与纯化的原则及要求 2. 核酸制备的基本步骤 3. 核酸的鉴定和保存 4. 核酸提取方法简介 6 1. 核酸分离与纯化的原则及要求 1.1 核酸分离与纯化的一般原则 (1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。 (2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。 7 1.2 核酸分离与纯化的要求 (1) 为保证核酸的完整性， （防止降解），在实验中应注意： 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学因素对核酸的降解，pH5-9。 化学因素？ 生物因素？ 物理因素？ 8 防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。 所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。 DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。 RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯 ）浸泡，器械180℃干烤8h。 9 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。 高温，如长时间的煮沸。 10 (2) 核酸纯度的要求： 非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子； 排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物； 去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。 11 2. 核酸制备的基本步骤 12 2.1 破碎细胞 (1)玻璃匀浆器匀浆 (2)液氮研磨法 多用于坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果 肝、肾等 冰上 少量 13 (3)高速组织捣碎机捣碎 (4)超声波处理法 (5)化学处理法(SDS、吐温80（油酸酯）等） (6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等） 14 2.2 核酸分离，去除蛋白 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 15 （1）加入SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能； （2） 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 16 （3）酚/氯仿抽提 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。 17 (1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。 使用酚时应注意 18 2.3 沉淀核酸 重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用； 去除溶液中某些盐离子与杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。 核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸 19 2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。 钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。 启示什么？ 20 核酸沉淀的盐类及浓度 盐 贮存液浓度（mol/L) 终浓度(mol/L) MgCl2 1 0.01 NaAc 3 (pH5.2) 0.3 KAc 3 (pH5.2) 0.3 NH4Ac 10 2.5 NaCl 5 0